壳聚糖对阿昔洛韦滴眼剂兔眼房水药动学的影响

宋玲，胡拥军，黄理

(1.湖北省妇幼保健院药剂科，湖北 武汉 430070； 2.武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉 430060)

阿昔洛韦(aciclovir，ACV)对单纯疱疹性角膜炎有较好的疗效，但ACV滴眼液存在因鼻泪管引流引起的全身不良反应、生物利用度低、药效维持时间短等缺点[1]。壳聚糖(chitosan，CS)为一种阳离子多糖，具有生物黏附性、生物相容性、促渗透性等特性，已广泛地应用于眼部给药系统[2]。本课题组前期已将CS作为增黏剂及吸收促进剂应用于ACV滴眼液中，并对其体外质量、家兔眼部刺激性及滞留性、对离体角膜渗透促进作用等进行了研究[3-4]。本部分研究拟以不加CS的ACV滴眼液(ACV)为对照，考察CS对ACV滴眼液在兔眼房水中药动学的影响，为进一步药效学研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；XW-80A漩涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；TD4台式离心机(湖南仪器仪表总厂离心机厂)。

1.2 试药

阿昔洛韦原料药(ACV，湖北潜江制药股份有限公司，批号：20180222，质量分数：99.55%)；ACV对照品(中国食品药品检定研究院，批号：140630-201802，质量分数：99.8%以上)；壳聚糖(CS，青岛海普生物技术有限公司，药用级，相对分子量210 000，脱乙酰度大于95%)；ACV-CS滴眼液、ACV滴眼液(质量浓度为0.1%，自制[3-4]，批号均为：20190511)；谷胱甘肽-碳酸氢钠林格溶液(GBR，使用前新鲜自配[4])；盐酸丁卡因(湖北健文生物医药有限公司，批号：20181203，配制成1%溶液备用)；磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.5，参照2015年版《中国药典》配制)；喷昔洛韦(penciclovir，PCV，中国食品药品检定研究院，批号：100147-201702，质量分数：99.5%)；以上及其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

日本大耳白兔，雌雄兼用，武汉生物制品研究所提供，普通级，体质量1.8～2.0 kg，合格证号：SCXK(鄂)2008-0003(00019663)。

2 方法与结果

2.1 滴眼液的制备[3-4]

2.1.1 ACV-CS滴眼液 ACV 1.0 g，CS 5.0 g，NaCl 6.8 g，羟苯乙酯0.3 g，注射用水加至1 000 mL。取羟苯乙酯溶于适量注射用水中，加入ACV、NaCl，搅拌使溶解，滤过。另取CS加入适量注射用水中，加入冰醋酸5 mL，使自然胶溶完全后，滤过。将上述2种溶液混合，搅匀，调节pH值至6.0～6.5，加注射用水至1 000 mL，搅匀，于100 ℃流通蒸气灭菌30 min，无菌分装即得。

2.1.2 ACV滴眼液 ACV 1.0 g，NaCl 6.8 g，羟苯乙酯0.3 g，注射用水加至1 000 mL。取羟苯乙酯溶于800 mL的注射用水中，加入ACV、NaCl，搅拌使溶解，用盐酸调节pH值至6.0～6.5，加注射用水至1 000 mL，搅匀，滤过，于100 ℃流通蒸气灭菌30 min，无菌分装即得。

2.2 分组给药及房水采集

采用每只白兔自身对照、交叉设计进行实验[5]。取55只健康白兔，随机分为11个时间组，每组5只(10眼)，采用微量取样器于眼结膜囊内滴加相应滴眼液60 μL(含ACV 60 μg)。给药后分别于10、20、40、60、90、120、150、180、240、300、360 min抽取房水样本：用生理盐水冲洗结膜囊及角膜表面，棉签蘸干，以1%盐酸丁卡因表面麻醉，用1 mL注射器抽取房水，再精密吸取100 μL于带塞的离心管中于-20 ℃下储存备用。经7 d清洗期后，交叉给药，同法处理。

2.3 房水样品中ACV的提取分离[6]

取房水100 μL，精密加入15 μg/mL PCV内标液5 μL，加入25%高氯酸溶液100 μL，振荡2 min，高速离心(10 000 r/min)20 min后，取上清液100 μL于1.5 mL离心管中，1 mol/L Na2CO3溶液60 μL调pH值至弱酸性，高速离心(10 000 r/min)20 min后，取上清液备用。

2.4 色谱条件

参考文献[7]，并通过预实验调整色谱条件如下：色谱柱为Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长为254 nm；流动相为甲醇-水(体积比15∶85)；流速为1.0 mL/min；柱温为35；灵敏度为0.02 UFS；进样量为10 L。以内标法进行测定，见图1，可见滴眼液中其他成分不干扰ACV的测定。

1.ACV； 2.喷昔洛韦； A.空白房水； B.辅料； C. ACV+内标液； D. ACV对照品； E.兔眼给药后房水。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线 精密称取ACV对照品5.0 mg，用纯水定容至100 mL，分别精密吸取0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL置于100 mL量瓶，用纯水定容，即得浓度分别为0.05、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 μg/mL的对照品溶液，各精密吸取10 μL，用空白房水稀释至50 μL，进样检测，以峰面积(A)与对应质量浓度(ρ)进行线性回归，得回归方程A=5.06×104ρ+2.68×103，r=0.999 8(n=6)，表明ACV质量浓度在0.01～1.00 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.4.2 提取回收率及精密度 取质量浓度分别为0.5、2.50、5.00 μg/mL的ACV对照品溶液10 μL，用空白房水稀释至50 μL，配制成0.10、0.50、1.00 μg/mL的ACV房水溶液，依照“2.2”项方法处理后进样检测，得到峰面积A1。每个浓度5份，每天连续测5次，连续测定5 d，计算日内及日间精密度。同时流动相溶液中加入适量ACV和内标溶液，配制成与房水质控样品理论进样溶液相同浓度的溶液进样分析，得峰面积A2。以A1/A2的比值求算ACV提取回收率。结果见表1，表明提取回收率较高，日内及日间精密度均较好。

2.4.3 稳定性试验

2.4.3.1 室温稳定性 精密配制低、中、高质量浓度的ACV房水样品(0.20、2.00、4.50 μg/mL)，每个浓度平行配制5份。室温下分别放置0、2、4、6、8 d进样检测，与0 d相比计算含量偏差。结果表明ACV房水样品在室温放置 8 d可保持稳定，RSD≤2.0%。

表1 提取回收率及精密度测定结果

2.4.3.2 冷藏稳定性 配制低、中、高质量浓度的ACV房水样品，于4 ℃冰箱中放置，每天测定，连续测定5 d，与0 d相比计算含量偏差。结果表明ACV房水样品在4 ℃下5 d内保持稳定，RSD≤1.5%。

2.4.3.3 冻融稳定性 同法配制低、中、高质量浓度的ACV房水样品，于-20 ℃冷冻24 h，取出自然完全解冻，再冷冻，反复循环3次，进样检测ACV含量，与未冻融前相比，结果表明，ACV房水样品冻融稳定性良好，RSD≤2.0%。

2.5 数据处理

主要药动学参数见表2、表3。对血药浓度及时间的数据进行房室模型拟合，表明2种制剂在兔眼房水的经时变化情况均符合二室模型(权重因子为1)，相关系数r2=0.999 9。给药20 min内，ACV滴眼液的房水药物浓度显著高于ACV-CS滴眼液，而20 min后，在各个时间点，ACV-CS滴眼液的血药浓度明显高于ACV滴眼液，Cmax为ACV滴眼液的1.31倍，AUC0-t为ACV滴眼液的1.77倍，说明ACV-CS滴眼液的吸收明显增加，生物利用度显著提高(P<0.05)。ACV滴眼液较快达峰，而ACV-CS滴眼液的Tmax显著滞后，且MRT显著延长(P<0.05)，说明ACV-CS滴眼液具有明显的缓释长效作用。

表2 ACV-CS滴眼液及ACV滴眼液兔眼房水中的药物浓度

表3 ACV-CS滴眼液及ACV滴眼液单次给药后兔眼主要药动学参数

3 讨论

本研究采用家兔自身对照、交叉设计法进行试验，可减少样本数且平行操作，结果较为可靠。

CS作为自然界唯一带正电荷的阳离子多糖，已经作为有效的吸收促进剂应用于眼部给药系统，其机理为CS正电荷有利于与角膜上带负电荷的黏蛋白结合，显著提高药物穿透角膜进入房水的吸收作用[8]。本课题组前期离体角膜渗透试验结果显示，由于CS的黏性，可增加ACV在眼部的滞留性，减少药液的流失，并发挥吸收促进作用，显著增加了ACV离体角膜的渗透性[4]。本文的体内研究结果与以上体外结果相似，ACV-CS滴眼液由于CS的黏性作用，均存在20 min的吸收时滞，但20 min后CS发挥明显的吸收促进作用，使ACV更容易穿透角膜进入房水，生物利用度明显增加，作用时间显著延长。CS作为ACV滴眼液的增黏剂及吸收促进剂，具有较好的研发价值。

本研究中CS的应用浓度为0.5%，初步安全性评估结果显示对家兔眼部没有明显刺激性[10]。CS的正电荷在发挥相应吸收促进剂的同时，也会对细胞产生一定的毒性[9]，故应对CS在ACV滴眼液中的使用浓度进一步优化，兼顾黏性、吸收促进作用及安全性。