基于指纹图谱与多元统计分析的栀子不同炮制品评价

黄跃前，程学仁，吴文平，朱德全，黄敏烨，杨晓东，罗宇琴，何广铭

(广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

栀子为传统药食两用资源，始载于《神农本草经》[1]。据2015年版《中国药典》收载，栀子为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实[2]，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒的功效，外用可消肿止痛，用于热病心烦、湿热黄疸、淋证涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮疡；外治扭挫伤痛。每年9～11月对果实成熟呈红黄色时的栀子进行采收，除去果梗和杂质，蒸至上气或置沸水中略烫，取出，干燥。因栀子性味苦寒，容易对脾胃造成损伤，脾胃较弱者服后易吐，炒制后能降低这种弊端造成的伤害[3-5]，自汉代以来非常重视对栀子的炮制处理[6]。现代常见的栀子炮制方法有清炒法(炒黄、炒焦、炒炭)、酒制法和姜制法等[7]，2015年版《中国药典》收录的炮制品有炒栀子与焦栀子[2]，炒栀子与焦栀子均以栀子照清炒法炮制，二者炒制程度不一样；炒栀子药效与栀子相近，而焦栀子凉血止血，并有较强的镇静和凝血作用。2015年版《中国药典》仅对栀子、炒栀子与焦栀子的栀子苷含量进行限定，不能全面反映栀子、炒栀子与焦栀子饮片的质量。

本研究拟建立《中国药典》2015年版收录的栀子炮制品(栀子、炒栀子、焦栀子)的指纹图谱方法，结合中药指纹图谱相似度评价系统与SIMCA-P对3者进行相似度评价及多元统计分析，找出各炮制品的差异组分，为栀子不同炮制品质量标准的建立及质量标志物的选择提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters H-Class型超高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；YMC Triart C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)色谱柱；XP26型百万分之一分析天平、ME204E型万分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ500D型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q Direct型超纯水系统(美国默克股份有限公司)。

1.2 试药

栀子苷(批号110749-201718，质量分数97.6%)、西红花苷-Ⅰ(批号111588-201303，质量分数92.6%)、西红花苷-Ⅱ(批号111589-201705，质量分数92.2%)对照品均由中国食品药品检定研究院提供；京尼平龙胆双糖苷(批号16120502，质量分数98.98%)由成都普菲德有限公司提供；甲醇为分析纯；乙腈为色谱纯；水为超纯水。

10批栀子药材(S01～S10)经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定，均为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实，炒栀子(CS01～CS10)与焦栀子(JS01～JS10)是10批栀子药材经炮制得到的饮片，详细信息见表1。

表1 10批栀子药材及其炮制品的来源信息

2 方法与结果

2.1 栀子炮制品的制备

栀子：取10批栀子原药材，拣去杂质，碾碎。

炒栀子：取10批栀子原药材，照清炒法(2015年版《中国药典》四部通则0213)用文火加热炒至黄褐色，取出，放凉，即炒栀子。

焦栀子：取10批栀子原药材，照清炒法(2015年版《中国药典》四部通则0213)用中火炒至表面焦褐色，果皮内表面或种子表面为黄棕色或棕褐色，取出，放凉[5]，即焦栀子。

2.2 对照品溶液的配制

分别精密称定京尼平龙胆双糖苷、西红花苷-Ⅰ、栀子苷、西红花苷-Ⅱ适量，加甲醇制成质量浓度为115.2、42.6、259.3、40.6 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的配制

取本品粉末(过四号筛)适量，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%(体积分数，下同)甲醇25 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 色谱条件

YMC Triart C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱(0～5 min，5%～20%A；5.01～9.5 min，26%～40%；9.5～11 min，40%～90%A；11.01～18 min，5%A)；流速为0.4 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长：0～6 min为238 nm，6～11 min为440 nm，11～18 min为238 nm。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 以同一供试品溶液按“2.4”项色谱条件连续测定6次，以峰5(栀子苷)为参照峰(S)，计算其余各共有峰的相对峰面积RSD值范围为0.27%～0.35%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 以同一供试品溶液按“2.4”项色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12 h后依次测定样品，以峰5(栀子苷)为参照峰(S)，计算其余各共有峰的相对峰面积RSD值为0.16%～0.31%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取S04样品6份，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件测定，以峰5(栀子苷)为参照峰，计算其余各共有峰的相对峰面积RSD值为0.48%～0.63%，表明方法重复性良好。

2.6 栀子、炒栀子与焦栀子指纹图谱的建立和共有峰的标定

分别将栀子、炒栀子与焦栀子的UPLC结果的“.cdf”文件导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012年版)，以中位数法，经多点校正再自动峰匹配得到3种炮制品的指纹图谱，其叠加图见图1，共有模式指纹图谱见图2。栀子、炒栀子与焦栀子均自动匹配了7个共有峰，其中峰4、5、6、7经与对照品比较，分别确认为京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ。

分别将10批栀子、炒栀子与焦栀子的UPLC指纹图谱与对照指纹图谱进行相似度评价，10批栀子的相似度在0.978～0.998之间；10批炒栀子的相似度在0.983～0.998之间；10批焦栀子的相似度在0.983～1.000之间，表明栀子各种炮制品的UPLC指纹图谱相似度较高。

图1 栀子(A)、炒栀子(B)与焦栀子(C)UPLC指纹图谱叠加图

2.7 偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)

3种栀子炮制品的指纹图谱相似度比较高，为了找出能区别不同炮制品的主要成分，取3种炮制品7个共有峰的指纹图谱数据导入SIMCA-P 12.0软件，采用有监督模式识别的OPLS-DA进行考察，建立3组OPLS-DA模型。3种炮制品共有峰OPLS-DA得分图见图3。OPLS-DA模型中，R2X(cum)与R2Y(cum)分别表示在X轴方向和Y轴方向上，主成分1和主成分2对变量的解释能力，Q2(cum)表示模型对分组的预测能力，3者数值越趋近于 1，模型的解释与预测能力越强[8]。栀子与炒栀子、栀子与焦栀子、炒栀子与焦栀子的R2X(cum)分别为0.940、0.987和0.897，R2Y(cum)分别为0.800、0.818、0.702，说明建立的3组OPLS-DA模型中的2个主成分均能有效解释3种炮制品之间的差异；栀子与炒栀子、栀子与焦栀子、炒栀子与焦栀子的Q2(cum)分别为0.453、0.616和0.486，说明该模型具有一定的预测能力。

A.对照品溶液； B.栀子； C.炒栀子； D.焦栀子； 峰4.京尼平龙胆双糖苷； 峰5.栀子苷； 峰6.西红花苷-Ⅰ； 峰7.西红花苷-Ⅱ。

在建立的OPLS-DA模型下，可生成共有峰相对峰面积的S-plot图，纵坐标 P(corr)代表每个组分的相关系数，P值的绝对值越大，对分组的贡献就越大。由图4可见，峰4[京尼平龙胆双糖苷，P(corr)=0.392]和峰6[西红花苷-Ι，P(corr)=0.302]对栀子与炒栀子分组贡献最大；峰6[西红花苷-Ι，P(corr)=0.809]和峰7[西红花苷-Ⅱ，P(corr)=0.608]对栀子与焦栀子分组贡献最大；峰6[西红花苷-Ι，P(corr)=0.708]、峰7[西红花苷-Ⅱ，P(corr)=0.547]和峰3[P(corr)=0.453]对炒栀子与焦栀子分组贡献最大。

图3 栀子与焦栀子(A)、栀子与炒栀子(B)、炒栀子与焦栀子(C)的OPLS-DA得分图

使用变量权重值(variable importance inprojection，VIP)也可以筛选出对组间分类贡献最大的组分。从图5可见，峰6(西红花苷-Ⅰ)对栀子与炒栀子、栀子与焦栀子、炒栀子与焦栀子的分组均有贡献，VIP值分别为1.367、1.851、1.674；峰7(西红花苷-Ⅱ)对栀子与焦栀子、炒栀子与焦栀子的分组有贡献，VIP值分别为1.379、1.303；峰4(京尼平龙胆双糖苷)对栀子与炒栀子的分组有贡献，VIP值为1.807。筛选出来的有贡献差异组分与S-plot得分图所得结果一致。

A.栀子与炒栀子；B.栀子与焦栀子；C.炒栀子与焦栀子。

3 讨论

本研究建立了栀子、炒栀子与焦栀子的UPLC指纹图谱，3个指纹图谱均标识出了7个共有峰，其中峰4、5、6、7分别为京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ。栀子指纹图谱的相似度在0.978以上，炒栀子指纹图谱的相似度在0.983以上，焦栀子指纹图谱的相似度在0.983以上。

A.栀子与炒栀子；B.栀子与焦栀子；C.炒栀子与焦栀子。

OPLS-DA分析可知，西红花苷-Ⅰ在栀子与炒栀子、栀子与焦栀子、炒栀子与焦栀子均存在明显差异，对区分3者贡献最大。这可能与栀子在炒制过程中所用的火候有关，炒栀子所用的是文火，焦栀所用的是中火，不同的炒制温度造成生品、炒黄品与炒焦品之间的差异。杜伟峰等[9]比较不同产地及其炮制品中绿原酸、栀子苷和西红花苷-Ⅰ的量，发现不同产地的栀子经炮制后3种成分的量均显著下降，焦栀子中各成分的量较炒栀子更低，在炒栀子与焦栀子中均检测不到西红花苷-Ⅰ，可能是由于清炒以及炒焦时的高热量导致这3种成分降解，焦栀子中西红花苷-Ⅰ含量最低是由于其受热的温度和时间均大于炒栀子。付小梅等[10]在西红花苷-I的稳定性研究中发现西红花苷-Ⅰ对温度敏感，随着温度的升高其半衰期缩短。西红花苷-Ⅰ是栀子黄色素的主要成分[12]，具有利胆、抗感染、抗氧化、抗肿瘤等作用[11-13]。2015年版《中国药典》中栀子与炒栀子均属于栀子的饮片，功效相同，均有抗感染、利胆等作用，而焦栀子仅保留凉血止血的功效[2]，这可能与其西红花苷-Ⅰ的含量偏低有关。李水清等[14]认为栀子生用善于清热泻火、凉血，而炒焦之后其收敛之性增强，增加了止血的功效。

本研究所建立的栀子不同炮制品的UPLC指纹图谱，能有效体现栀子不同炮制品作用差异，可为栀子不同炮制品的质量标准提升提供一定的参考价值。