UPLC-MS-MS法同时测定玉屏风颗粒中6种皂苷类成分

胥爱丽，钟惠娴，杨小龙，毕晓黎，肖观林，陈昭，江洁怡

(1. 广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095； 2.广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095； 3.广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244； 4.广州中医药大学第五临床医学院，广东 广州 510405)

玉屏风颗粒由黄芪、炒白术、防风3味药组成，作为经典的中药免疫调节剂，主治“表虚不固，自汗恶风，面色?儯&白，或体虚易感风邪者”，临床上广泛应用于机体免疫力的提高以及免疫功能失衡/低下引起的反复感冒、过敏性鼻炎、哮喘等各种疾病[1-7]。方中黄芪补肺益气、固表止汗，是为君药。黄芪主要含有多糖、黄酮及皂苷类成分，其中黄芪皂苷具有多种药理活性。研究表明，黄芪皂苷能提高小鼠血清IL-2、IL-4含量，恢复低下的细胞免疫；降低IL-6含量，保护化疗引起的骨髓造血功能损伤，促进正常造血功能的恢复，还可升高不同证型小鼠人免疫球蛋白G(IgG1)、IgG2水平，调节小鼠IL-2/IL-4平衡，即提高IL-2水平，降低IL-4水平，以提高机体免疫力，提示黄芪皂苷在免疫系统疾病的治疗方面发挥着重要的作用，与玉屏风颗粒的功效密切相关[8-10]。

目前，对玉屏风颗粒的质量控制以黄芪甲苷、黄酮类的单一成分指标含量为主，也有UPLC-DAD指纹图谱及UPLC-MS多成分含量测定的报道，但其皂苷类成分的多指标成分同时测定方法却尚未有报道[11-15]。本研究采用UPLC-MS法同时测定方中黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ共6个皂苷类成分的含量，为全面评价玉屏风颗粒的质量提供有效、快速的方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters UPLC- Xevo TQ-S micro三重四极杆液质联用仪(美国沃特斯公司)；XS205DU梅特勒电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ700-DE型数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

黄芪甲苷(批号：H-013-170614)、黄芪皂苷Ⅰ(批号：H-038-160905)、黄芪皂苷Ⅱ(批号：H-037-161216)、黄芪皂苷Ⅲ(批号：H-036-160908)的质量分数均为98%，均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；异黄芪皂苷Ⅰ(批号：AF-8051838)、异黄芪皂苷Ⅱ(批号：AF-8051839)的质量分数均为98%，均购自成都埃法生物科技有限公司；乙腈、甲酸(色谱纯，德国Merck)，水为超纯水；甲醇(分析纯，广州化学试剂厂)；10批玉屏风颗粒由国药集团广东环球制药有限公司提供，批号分别为170329、170521、170703、170818、171012、171102、171203、180113、180317、180411。

2 方法与结果

2.1 LC-MS检测条件

2.1.1 质谱条件 ESI离子源，喷雾电压2 300 V，汽化室温度500 ℃，鞘气(N2)流速：900 L/h，碰撞气(Ar)流速：1 L/h，离子传输管温度150 ℃；各待测组分及内标质谱参数见表1。

2.1.2 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流动相：乙腈(A)-水溶液(B)，梯度洗脱(0～5 min，10%～27%A；5～11 min，27%～35%A；11～16 min，35%～50%A；16～20 min，50%～100%A)；流量：0.30 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：2 μL；黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ的离子流图分别见图1～2。

表1 玉屏风颗粒中6种待测化合物的质谱条件

1.黄芪甲苷； 2.黄芪皂苷Ⅲ； 3.黄芪皂苷Ⅱ； 4.异黄芪皂苷Ⅱ； 5.黄芪皂苷Ⅰ； 6.异黄芪皂苷Ⅰ。

图2 各待测成分离子流图

2.2 供试品溶液的制备

取本品颗粒约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液100 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.3 对照品溶液的制备

分别取黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ对照品适量，精密称定，加甲醇制成黄芪甲苷35.5 μg/mL、黄芪皂苷Ⅲ 125.0 μg/mL、黄芪皂苷Ⅱ74.5 μg/mL、异黄芪皂苷Ⅱ63.0 μg/mL、黄芪皂苷Ⅰ81.0 μg/mL、异黄芪皂苷Ⅰ58.0 μg/mL的对照品储备液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系的考察 分别精密吸取不同体积各对照品储备液适量，置10 mL量瓶内，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得系列质量浓度的混合对照品溶液，分别精密吸取2 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项检测条件进行测定，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，求得对数回归方程及线性范围分别为：黄芪甲苷，y=2 564x+151.5，r=0.999 8，0.1775～3.55 μg/mL；黄芪皂苷Ⅲ，y=58 173x- 712.6，r=0.999 5，0.0625～1.25 μg/mL；黄芪皂苷Ⅱ，y=1 675x+114.7，r=0.999 7，0.298～5.96 μg/mL；异黄芪皂苷Ⅱ，y=1 565x+46.24，r=0.999 5，0.1575～3.15；黄芪皂苷Ⅰ，y=1 232x+8.630，r=0.999 6，0.202 5～4.05；异黄芪皂苷Ⅰ，y=1 125x+79.59，r=0.999 7，0.29～5.8 μg/mL。

2.4.2 精密度试验 取同一批供试品(171102)，按“2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项条件连续进样6次，结果黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ色谱峰峰面积的RSD值分别为1.28%、1.33%、0.99%、1.47%、1.50%、1.37%，表明方法精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批供试品(171102)，按“2.2”项方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件依次测定，结果黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ质量分数的RSD值分别为2.58%、2.76%、2.12%、1.56%、1.43%、1.08%，表明方法重现性良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一批供试品(171102)，按“2.2”项方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样测定，结果黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ色谱峰峰面积的RSD分别为1.27%、1.26%、1.98%、1.82%、1.90%、1.82%，表明供试品溶液中的各成分在12 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验 取同一批供试品(170329)约0.5 g，精密称定6份，分别加入相应浓度的黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ对照品溶液各0.1 mL(此处对照品为另外配制，并非使用2.3项下的对照品来配制的)，挥干溶剂，再按“2.2”项方法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件依次测定，计算加样回收率，结果表明黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ分别为100.64%、97.66%、100.89%、104.57%、101.73%、98.19%，RSD分别为3.54%、1.93%、2.63%、2.42%、3.35%、2.57%，见表2。

2.4.6 样品定量测定 取10批玉屏风颗粒样品，按“2.2”项方法制备供试品溶液，并按“2.1”项条件进行测定，计算各样品中黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ质量分数，结果见表3。

表2 玉屏风颗粒中6种成分的加样回收率试验结果

表2 (续)

表3 10批玉屏风颗粒中6种成分质量分数测定结果

3 讨论

采用UPLC-MS法测定制剂中成分的含量，由于是用待测组分的不同离子对来定性，因此方法对色谱条件的分离度要求不高，但玉屏风颗粒中的黄芪所含的皂苷类成分结构较相似，会出现质荷比和碎片离子均相同的情况，故在建立多个皂苷类成分同时测定的方法时对色谱分离度有一定的要求，还需结合出峰时间来对待测组份进行定性。皂苷类成分常采用蒸发光散射检测器(ELSD)进行测定，但该检测器重现性较差，影响因素较多，可被液质联用法取代。

本研究先后考察了不同溶剂(甲醇和50%甲醇)、不同提取时间(15、30、60 min)，结果以甲醇提取效果较好，提取时间为30 min时可提取完全。对不同流动相系统(乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液)进行考察，结果显示流动相中加入甲酸后各成分的分子离子峰响应较高，且峰形较好，在该方法确定的流动相梯度洗脱下，各峰均能较好地分离，能准确地对各成分进行定量。

本研究建立了同时测定玉屏风颗粒中6个皂苷类成分(黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ)的定量分析方法，结果表明该制剂10批样品之间差异较小，批次之间质量较稳定，说明玉屏风颗粒作为全国名优中成药，其工艺稳定，原料质量控制严格，从而保证了制剂成品的质量稳定。该方法快速、简便、结果准确，对全面控制玉屏风颗粒的质量具有指导意义。