NF-κB表达在胰腺癌的诊断和预后中的价值*

郭江福，范伟，张莹

(贵州省人民医院 急诊外科，贵州 贵阳 550002)

研究报道，我国消化道恶性肿瘤发生率逐年上升，胰腺癌发生率也逐年上升[1-2]，其5年生存率仅1%～3%。与其他恶性肿瘤一样，肿瘤的预后与肿瘤细胞的分期、组织免疫以及生物化学特征有关[3-4]。研究认为，转录因子B(nuclearfactor kappa B，NF-κB)在人体固有免疫和适应性免疫反应上发挥重要作用，是引起人体炎症、肿瘤的关键点[5-7]。最新的研究也显示NF-κB在胰腺炎等胰腺疾病中也发挥重要作用[8-10]。本研究选择2014年4月—2016年7月收集的胰腺癌样本及相应癌旁组织各67例、良性胰腺肿瘤样本45例，采用免疫组织化学方法检测NF-κB在3组标本中的表达水平，评价其对胰腺癌诊断、浸润及转移中的评估价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料、主要试剂及仪器

1.1.1临床资料 2014年4月—2016年7月进行手术、2018年7—12月复诊随访患者(≥24个月)的保存完好的胰腺癌样本67例、相应病例癌旁样本67例，另选择同期良性胰腺囊肿及胰腺炎等手术患者的标本45例。要求所有的组织标本保存完好、患者和(或)家属知情同意、病理诊断明确和临床确诊，胰腺癌患者为原发胰腺癌、术后随访时间≥24个月。胰腺癌组(含癌旁组织)男44例、年龄女23例，41～89岁、平均(61.4±9.6)岁，高分化16例、中分化34例、低分化17例；同期手术的良性胰腺疾病手术标本45例，男30例、女15例，年龄37～88岁、平均(58.4±12.4)岁；2组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2主要试剂与仪器 兔抗人多克隆抗体(上海信裕生物科技有限公司，Abcam)、PBS冲洗液(北京百灵克生物科技有限公司，博士德，AR0194-10)、RM2235石蜡切片机(瑞沃德生命科技有限公司，Leica)、BX51型显微镜(日本奥林巴斯有限公司，Olympus)、HGPN-II,HGPF隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)。

1.2 方法

组织标本采用4%中性甲醛固定、脱水、石蜡包埋，4 μm切片、HE染色。采用高温高压法进行抗原修复、DAB显色，采用NF-KF即用型抗体，严格按照说明书进行操作。主要步骤：(1)石蜡切片脱蜡、水化，PBS冲洗3次，每次4～5 min；(2)每张切片滴加3%过氧化氢，阻断内源性过氧化物酶，室温下孵育10～15 min，PBS冲洗3次、每次3～5 min；(3)切片加入抗原修复液、微波炉加热，92～97 ℃持续10～15 min；(4)室温冷却20～30 min、PBS冲洗，滴加一抗、室温孵育60 min，PBS冲洗3次、每次3～5 min；(5)每张切片滴加二抗、室温下孵育30～60 min，PBS冲洗3次、每次3～5 min；(6)滴加新鲜配置的DAB溶液，显微镜下观察，蒸馏水冲洗，苏木素染色，梯度酒精脱水，中性树胶固定。

1.3 观察指标

观察胰腺癌癌组织、相应癌旁组织及胰腺良性疾病组织标本中NF-κB阳性细胞表达强度(Uc)、计算NF-κB阳性细胞百分率、制作受试者工作特征(ROC)曲线及计算截断值，分析NF-κB阳性细胞表达水平对胰腺癌诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值及符合率；胰腺癌患者术后随访24个月，观察胰腺癌患者发生淋巴结转移及远处转移与NF-κB阳性细胞表达水平的关系。NF-κB阳性细胞Uc：NF-κB染色定位于癌细胞的胞浆、胞核，呈棕黄色或棕褐色，细胞着色越深，则蛋白表达越强；40×10倍显微镜计算5 mm×10 mm网络微格中的阳性细胞百分率，阳性细胞数<25或不着色为影响(-)、阳性细胞数25%～50%或胞浆染色棕黄色为弱阳性(+)、阳性细胞数50%～70%或胞浆棕黄色为中等阳性(++)、阳性细胞数70%以上或胞浆棕褐色为强阳性(+++)。NF-κB阳性细胞的分级采用积分制度:“-”、“+”、“++”、“+++”分别计作为1、2、3、4分。阳性细胞百分率=所有的阳性细胞积分/(阳性细胞数×4)×100%。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，NF-κB阳性细胞采用中位数与四分位距M(P25～P75)表示，不同样本的NF-κB表达分级比较采用秩和检验，鉴别诊断效用采用描述性分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF-κB阳性细胞表达

胰腺癌组织NF-κB表达强度(++～+++)高于癌旁组织(Uc=2.866，P<0.05)、良性胰腺疾病(Uc=4.330 1，P<0.001)，癌旁组织的Uc值高于良性胰腺疾病(Uc=2.278，P<0.05)。见图1和表1。

图1 胰腺癌及相应癌旁组织、胰腺良性疾病组织NF-κB阳性细胞表达Fig.1 NF-κB expression levels in pancreatic cancer tissues, their corresponding adjacent tissues，and pancreatic benign tissues

表1 胰腺癌组织及相应癌旁组织、良性胰腺疾病组织标本中NF-κB阳性细胞[n(%)]Tab.1 Expression intensity of NF-κB in pancreatic cancer tissues, their corresponding adjacent tissues，and pancreatic benign tissues[n(%)]

2.2 NF-κB阳性细胞表达水平对胰腺癌的诊断价值

胰腺癌组织与良性胰腺疾病的NF-κB表达水平截断值为22%，ROC下曲线面积为0.842。见图2。置信区间(0.769～0.915，P<0.001)，诊断灵敏度91.0%(61/67)，特异度75.6%(34/45)，阳性预测值84.7%(61/72)，符合率84.8%(95/112)。

图2 胰腺癌患者NF-κB阳性细胞表达水平的ROC曲线Fig.2 ROC curve analysis of the diagnosis value of NF-κB expression levels in patients with pancreatic cancer

2.3 胰腺癌转移和复发与NF-κB阳性细胞的表达

胰腺癌患者确诊时，已经发生淋巴结转移24例，NF-κB阳性细胞分级为(NF-κB阳性细胞百分比)44%(38～64)，高于无淋巴结转移患者[43例，NF-κB阳性细胞分级29%(16～41)]，差异有统计学意义(Z=2.445，P<0.001)；术后随访24个月，胰腺癌患者发生肿瘤扩散、转移、复发40例，NF-κB阳性细胞百分比42%(36～62)，高于无瘤生存的患者[27例，NF-κB阳性细胞百分率30%(17～42)]，差异有统计学意义(Z=2.412，P<0.05)。

3 讨论

NF-κB是一种具有多方向性转录调节的蛋白子因子，参与了机体炎症反应、免疫调节及细胞生长与凋亡等重要病理生理过程，NF-κB在肺非小细胞癌、前列腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤细胞中呈现高表达[11-12]。有研究表明，NF-κB在胰腺癌组织中高表达，但其在胰腺癌组织种所起作用尚未明确[13-16]。有学者发现，当组织及细胞发生炎症等改变时会持续激活NF-κB促细胞恶性转变，而NF-κB信号通路的持续激活会抑制细胞凋亡、刺激细胞的突变，其中NF-κB p65可能在胰腺癌发生中发挥重要作用[17-19]。另一方面，当NF-κB被激活后，可以促进多种炎症因子、抗凋亡蛋白的转录，影响下游IL-6、IL-8、TNF-α、BCL-xL等蛋白的表达，这些蛋白表达异常将会增加细胞的突变率[20-21]，促使胰腺癌发生。本实验免疫组化结果提示：胰腺癌组织NF-κB表达强度分级以及表达水平高于癌旁组织、良性胰腺疾病，而癌旁组织高于良性胰腺疾病；NF-κB在胰腺良性疾病中亦有表达，认为这可能与胰腺疾病时存在炎症反应有关，且表达水平也明显低于胰腺癌。

本实验ROC结果显示，胰腺癌组织与良性胰腺疾病的NF-κB表达水平截断值为22%，以此作为鉴别诊断依据，其中诊断胰腺癌灵敏度91.0%、特异度75.6%、符合率84.8%，高于其他文献报道的结果[22-23]，这可能与诊断的依据标准差异有关，本次研究中采用积分截断值进行诊断，而其他文献单纯的采用阳性表达进行鉴别诊断。NF-κB在肿瘤发生相关的细胞因子分析中属于中间段，其在炎症、恶性病变中均发挥作用，良性胰腺病变也会出现较高的NF-κB表达[24-25]。因此，单纯根据阳性表达鉴别诊断胰腺癌容易导致假阳性。因此，欲提高诊断效用，可联合NF-κB上下游蛋白的检测。

本研究中，确诊时胰腺癌淋巴结转移患者的NF-κB表达水平高于无转移患者，术后随访24个月时胰腺癌出现扩散、转移、复发患者NF-κB表达水平高于无瘤生存患者(P<0.05)，提示NF-κB表达水平可作为淋巴结转移的辅助判断依据，还可用于判断患者的预后，NF-κB高表达的患者出现淋巴结转移、疾病进展的风险更高。有学者认为NF-κB表达可能与急性胰腺炎症关系更为密切，即胰腺炎症病情越严重，胰腺中NF-κB表达也越较高[26-27]。因此，检测组织标本的NF-κB表达水平时，还应考虑患者的病史。