大蒜素通过TLR4/NF-κB途径对慢性腹泻大鼠肠黏膜修复和炎性因子的调节作用*

赖雁威，刘丽娟，黄艳平，武敬**

(1.北京大学深圳医院 药学部, 广东 深圳 518036； 2.罗湖区人民医院 药学部，广东 深圳 518001)

慢性腹泻病因复杂，涉及感染、过敏、免疫缺陷、先天畸形、酶缺陷、肠动力缺陷等机制，在婴幼儿中的发病率较高，对儿童生长发育危害较大[1]。临床对慢性腹泻病的治疗多围绕调节肠道分泌展开，常用抗腹泻药物包括洛哌丁胺、蒙脱石散等，儿童应用蒙脱石散的安全性高，对消化系统内病菌、细菌及毒素均有抑制作用，可保护消化道黏膜，提高黏膜屏障防御功能，目前广泛应用慢性腹泻治疗中，但也存在禁忌症多，长期应用可能引起便秘、腹胀等不良反应[2-3]。大蒜素是从大蒜球茎分离的一种二烯丙基三硫化物，具有典型抗炎、抗氧化、抗真菌等的生物学活性，有研究报道，大蒜素对溃疡性结肠炎肠黏膜存在典型的保护作用[4]；也有试验研究发现大蒜素可通过抑制Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路信号转导，避免核因子激活，减轻心肌的炎症反应[5]。关于大蒜素对慢性腹泻肠黏膜调节作用及对肠黏膜TLR4/NF-κB信号通路的影响未见报道，为探讨大蒜素对慢性腹泻的干预价值及可能机制，本研究对复制的慢性腹泻大鼠模型给予大蒜素灌胃，并以空白组、模型组及蒙脱石散组作为对照，探究大蒜素对慢性腹泻大鼠肠黏膜修复及肠黏膜TLR4/NF-κB信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 清洁级健康雄性Wistar大鼠40只，4～5周龄，体质量80～150 g，平均(110.7±10.5)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[许可证号SCXK(沪)2018-0002]。大鼠统一独立饲养，空气洁净度10 000级，室温20～25 ℃，相对湿度60%，空气交换次数10～15 次/h，光照周期明暗比为12 h ∶12 h，全价鼠颗粒饲料喂养，自由摄食饮水。

1.1.2主要药物、试剂与仪器 大蒜素注射液(辰欣药业股份有限公司)、蒙脱石散(海南先声药业有限公司)，白介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)以及D-乳酸酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒均购自福州迈新生物科技有限公司，琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)、淀粉酶活性检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)，D-木糖比色法检测试剂盒(美国Sigma公司)、苏木素伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂盒(北京中杉生物工程公司)、Trziol 总RNA抽提试剂盒(北京天根生物技术有限公司)、逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒(日本TaKaRa公司)、GR-B2074FNA型低温冰箱(韩国LG公司)、超速低温离心机(德国eppendorf公司)，JB-L6型包埋机及JJQ-P2016J型切片机(购自武汉俊杰电子有限公司)，PB203-N型电子天平(德国Sartorious公司)、ELX808型酶标仪(美国Bio-Tek公司)、CX21型光学显微镜(日本OLYMPUS公司)以及ABI7500型全自动荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1分组、建模及给药 40只健康雄性Wistar大鼠40只随机分为空白组、模型组、蒙脱石散组与大蒜素组，每组10只；除空白组外，均以水环境小平台站立法联合高乳糖饲料喂养建立慢性腹泻大鼠模型[6]，高乳糖饲料持续喂养2周，并每天将大鼠置于特质凸面小木台(周边注水)8～10 h，自由活动，见大鼠精神萎靡、皮毛稀疏、肛门口粪便污染、腹部膨隆及持续腹泻，视为建模成功[7]。腹泻动物模型复制成功后，蒙脱石散组给予1.0 g/kg蒙脱石散药液灌胃，大蒜素组给予30 mg/kg大蒜素注射液(人等效剂量)灌胃，空白组、模型组均给予15 mL/kg生理盐水灌胃，1次/d，持续1周。

1.2.2腹泻情况观察 给药1周后观察每只大鼠排便情况，以腹泻指数、稀便率、稀便等级作为腹泻评估标准[8]。腹泻指数=稀便率×稀便等级，稀便率=每只大鼠所排稀便量(以稀便污染滤纸直径判断)/每只动物总粪便量×100.0%；稀便等级用于评估稀便程度，以稀便污染滤纸直径作为分级标准，直径<1 cm为1级、直径1～1.9 cm为2级、直径2～3 cm为3级、直径>3 cm为4级，以各组大鼠稀便分级均值作为各组稀便等级。腹泻率=腹泻大鼠数目/各组大鼠总数量×100.0%。

1.2.3采样、肠胃吸收功能及通透性评估 末次给药1 h时番泻叶浸液灌胃、2 h时以3%D-木糖灌胃(20 mL/kg)。末次给药12 h时，戊巴比妥麻醉，腹部备皮、消毒、经腹部正中线打开腹腔，分离腹主动脉，采集腹主动脉血，离心后分离血清用于D-木糖、D-乳酸含量及炎症因子、能量代谢因子水平测定，并结扎回盲及幽门部，取小肠组织，称湿重，烘干96 h时继续称重，以减重法[9]计算小肠含水量；取小肠下段，用于肠黏膜组织学观察及肠黏膜组织TLR4、NF-κBmRNA表达水平检测。

1.2.4D-木糖、D-乳酸含量及炎症因子、能量代谢因子水平测定 取各组大鼠血清，采用比色法测定D-木糖含量及SDH、淀粉酶活性，ELISA法测定D-乳酸、IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2水平[10]。

1.2.5肠黏膜组织学改变 取2 cm小肠下段，观察肠黏膜充血及水肿情况，剪开肠管，4%多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，自来水冲洗，苏木素染液染色5～13 min，自来水冲洗1～5 min，梯度乙醇分化，自来水冲洗，返蓝，洗涤后加入伊红染液染色5 min，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察肠黏膜水肿、炎细胞浸润、溃疡、上皮损伤情况并评分。(1)肠黏膜水肿：无水肿为0分，轻度水肿为1分，中度水肿为2分，重度水肿为3分。(2)炎细胞浸润：无浸润为0分，浸润黏膜下层为1分，浸润肌层为2分，浸润浆膜层为3分。(3)溃疡：无溃疡为0分，溃疡深度累及黏膜下层为1分，溃疡深度累及肌层为2分，溃疡深度累及浆膜层为3分。(4)上皮损伤：无损伤为0分，出现溃烂为1分，出现溃疡为2分。随机取5个高倍视野测定绒毛高度与绒毛表面积(绒毛半径×绒毛高度)[11]。

1.2.6肠黏膜组织TLR4、NF-κBmRNA表达 采用逆转录-实时荧光定量PCR(RT-PCR)法测定小肠组织TLR4、NF-κBmRNA表达，参照Trizol抽提试剂盒使用说明提取小肠组织RNA，紫外分光光度确定浓度及纯度满意后逆转录合成cDNA，逆转录体系为总RNA 5 μg+随机引物2 μL+无RNA酶纯化水补足至13 μL，逆转录条件为65 ℃加热10 min变性，冷却；反应管内加入5×逆转录缓冲液4 μL + R Nase抑制剂0.5 μL +dNTP混合液2.0 μL+逆转录酶0.5 μL，加热至85 ℃，共5 min，逆转酶失活后，停止反应，获得cDNA，TLR4、NF-κB及内参引物设计及合成均由上海生工生物工程有限公司设计及合成，具体见表1。PCR扩增反应体系为2×SYBR Green Master Mix 5 μL+上下游引物各1 μL+cDNA模板1 μL+双蒸水补足至10 μL。反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，共42个循环，每样本均设3复孔，参照2-△△Ct公式计算TLR4、NF-κBmRNA相对表达量[12]。

表1 TLR4、NF-κB及内参引物序列Tab.1 Primer sequences of TLR4, NF-κB, and internal control gene

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠腹泻情况

由表2可见，治疗1周时，模型组、蒙脱石散组、大蒜素组大鼠的稀便率、稀便等级、腹泻指数及腹泻率均高于空白组(P<0.05)；蒙脱石散组、大蒜素组稀便率、稀便等级、腹泻指数及腹泻率低于模型组(P<0.05)；蒙脱石散组、大蒜素组腹泻情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 治疗1周时各组大鼠腹泻情况Tab.2 Diarrhea status in each group after 1 week

2.2 胃肠吸收功能及通透性

由表3可见，治疗1周时，空白组、蒙脱石散组、大蒜素组D-木糖水平高于模型组，D-乳酸水平低于模型组(P<0.05)；蒙脱石散组、大蒜素组、空白组D-木糖、D-乳酸水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，各组小肠含水量对比差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠胃肠吸收功能及通透性比较Tab.3 Gastrointestinal absorption function and

2.3 血清IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、SDH及淀粉酶

由表4可见，治疗1周时模型组、蒙脱石散组、大蒜素组血清IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2均高于空白组(P<0.05)；蒙脱石散组、大蒜素组IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2低于模型组，SDH、淀粉酶活性高于模型组(P<0.05)；蒙脱石散组、大蒜素组以上指标对比差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、SDH及淀粉酶水平Tab.4 Serum levels of IL-1β, IL-6, TNF-α, PGE2, the activities of SDH，and amylase in each

2.4 肠黏膜组织学观察

由表5可见，治疗1周时，模型组、蒙脱石散组、大蒜素组大鼠的肠黏膜水肿、炎细胞浸润、溃疡、上皮损伤评分均高于空白组(P<0.05)，绒毛高度、绒毛表面积低于空白组(P<0.05)；蒙脱石散组、大蒜素组大鼠的肠黏膜水肿、炎细胞浸润、溃疡、上皮损伤评分低于模型组，绒毛高度、绒毛表面积高于模型组(P<0.05)；蒙脱石散组、大蒜素组大鼠的以上指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠肠黏膜病理及形态改变见图1。空白组大鼠的肠黏膜形态正常，无明显病理改变，黏膜肌层厚度正常，绒毛高度正常；模型组大鼠的小肠黏膜肌层变薄、绒毛缩短，伴不同程度绒毛顶部上皮细胞脱落，见明显充血、水肿，不同程度溃疡；蒙脱石散组及大蒜素组大鼠的肠黏膜仅有轻度充血及水肿，肌层厚度基本恢复正常，绒毛高度增加、炎性浸润减轻。

表5 各组大鼠肠黏膜组织学观察Tab.5 Histological observation of intestinal mucosa in each

图1 各组大鼠肠黏膜组织(HE,×100)Fig.1 Intestinal mucosa tissues in each group (HE,×100)

2.5 大鼠肠黏膜组织TLR4、NF-κB mRNA表达

由表6可见，治疗1周时，模型组、蒙脱石散组、大蒜素组大鼠肠黏膜组织TLR4、NF-κBmRNA表达水平均高于空白组(P<0.05)，蒙脱石散组、大蒜素组低于模型组(P<0.05)，蒙脱石散组与大蒜素组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表6 各组大鼠肠黏膜组织TLR4和NF-κB mRNA表达Tab.6 The expression levels of TLR4 and NF-κB mRNA in intestinal mucosa tissues in each group

3 讨论

有研究报道，因腹泻所致婴幼儿死亡率超过10%，世界范围内每年死于腹泻患儿超过200万[13]。慢性迁延、持续性腹泻约占全部腹泻的60%，常导致肠黏膜转运障碍、消化酶分泌异常，影响儿童营养物质吸收，对其生长发育造成不良影响[14]。前期诸多报道均认为血管活性肠肽、生长抑素动态平衡打破，免疫抑制，结膜体表电活动异常等与慢性腹泻发生有关[15]。近年来较多证据显示，TLR4所诱导NF-κB活化而引起炎症反应参与炎症性肠病、腹泻型肠易激综合征发病过程，或可能与慢性腹泻发生有关[16]。本研究采用水环境小平台站立法联合高乳糖饲料喂养法成功复制了慢性腹泻大鼠模型，使大鼠摄入超消化负荷乳糖，形成高渗环境，导致水电解质紊乱，引发腹泻。发现慢性腹泻模型组大鼠呈现活动减少、腹部膨隆、皮毛稀疏等表现，腹泻率、腹泻指数、稀便率及稀便等级均较高，提示采用该方法复制慢性腹泻模型有较高的可行性。同时本试验还发现，慢性腹泻模型大鼠肠黏膜组织TLR4、NF-κBmRNA均较空白组高，同时相关炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2均高于空白组，推测慢性腹泻常伴TLR4/NF-κB通路活化，导致NF-κB下游靶点激活，释放大量炎症因子，与NF-κB DNA结合，加重肠黏膜炎症浸润程度。

而大蒜素为大蒜含硫化合物成分，有典型抗炎、抗感染、杀菌、抗氧化等作用[17]。已有研究证实，大蒜素主要成分可通过诱导细胞凋亡途径抑制结肠癌细胞分化、增殖[18]。也有报道指出，大蒜素可通过干扰核因子转录激活保护肠黏膜功能，促进肠黏膜修复[19]。本试验发现，慢性腹泻大鼠模型经大蒜素注射液灌胃1周后TLR4、NF-κBmRNA相对表达量较模型组明显降低，与空白组相对接近，同时大鼠腹主动脉炎性因子表达均降低，能量代谢酶SDH及淀粉酶活性均上升，D-木糖上升，D-乳酸水平降低，肠黏膜受损改善，充血、水肿、溃疡及炎症浸润程度明显减轻，绒毛高度基本恢复正常，肠黏膜能量代谢速度加快，肠道吸收能力增强，腹泻症状改善，腹泻指数及腹泻率均降低，与蒙脱石散组(阳性对照)接近，提示大蒜素与蒙脱石散存在类似的拮抗腹泻作用，推测大蒜素可能通过干扰TLR4/NF-κB信号转导发挥抗炎作用。NF-κB为TLR4下游信号通路，系炎症反应中最关键转录因子，参与免疫调节及炎症细胞增殖、分化等过程，而大蒜素有其独特抗炎、抗菌、免疫调节作用，可抑制TLR4/NF-κB信号通路下游NF-κB信号激活，阻止活化后炎症因子释放及其与NF-κB结合，降低TLR4、NF-κBmRNA表达，阻止NF-κB持续激活所致炎性反应，形成正向调控机制，抑制该通路活化后胃肠刺激相关因子表达，降低大鼠肠黏膜炎性浸润程度，恢复肠黏膜正常能量代谢，提升肠道酶活性，平衡肠道消化吸收功能，促进肠黏膜修复，进而改善腹泻、降低腹泻率与腹泻指数[20-21]。

综上所述，本研究结果显示，TLR4/NF-κB信号通路活化可放大炎症效应，影响肠道能量代谢，导致肠黏膜功能受损，影响肠道消化吸收，造成慢性腹泻；而大蒜素可能通过干扰TLR4/NF-κB信号转导，抑制下游NF-κB活化，抑制炎症因子释放，恢复肠道酶活性及能量代谢，改善肠黏膜功能，促进慢性腹泻大鼠肠黏膜修复，或可能为慢性腹泻治疗研究的新靶点。