高通量测序分析六味地黄汤对肝肾阴虚型妊娠期便秘患者肠道菌群的影响*

周平，殷文静，温济英，梁海英，邢佳玲，陈丹玲

(广东省妇幼保健院 妇产科，广东 广州 511400)

功能性便秘作为一种常见的胃肠功能失调疾病，由非器质性因素引起排便间隔时间延长、粪便干结及排便困难为主要临床特征[1]。孕妇由于孕激素分泌增多、增大的子宫压迫胃肠道及直肠、饮食结构不合理及日常活动量减少等因素，常发生妊娠期功能性便秘，且近年来发病率逐年上升[2-3]。妊娠期便秘若不及时干预可引发宫缩、出现流产或早产，甚至诱发心血管疾病如子痫前期等并发症。目前临床上对于妊娠期便秘的处理大都选择口服乳果糖等泻剂治疗或口服益生菌等微生态治疗，但这类方法易产生依赖性及出现腹泻等胃肠道不良反应[4]。中药辅助治疗妊娠期功能性便秘因其副作用低、依赖性低及复发率低等特点，已被越来越多的患者接受[5]。功能性便秘的病理生理机制复杂尚未完全明确，普遍观点认为肠道菌群的改变是功能性便秘的主要发病机制[6-7]。随着分子技术的快速发展，高通量焦磷酸测序技术已被广泛用于肠道菌群分析[8]。六味地黄汤作为经典的滋肾补阴汤剂，尚无研究将其应用于治疗肝肾阴虚型妊娠期便秘。因此，本研究拟通过采用高通量焦磷酸测序分析六味地黄汤对肝肾阴虚型妊娠期便秘患者肠道菌群的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1—5月门诊产检并诊断为肝肾阴虚型妊娠期便秘患者28例作为研究对象。纳入标准：(1)符合中、西医诊断标准，即西医诊断参照功能性便秘罗马Ⅲ诊断标准[9]、中医诊断参照《中药新药临床指导原则》中的标准，辨证为肝肾阴虚型[10]；(2)近6个月未使用抗生素、益生菌和其他导致便秘的药物；(3)签署知情同意书，依从性好。排除标准：(1)有自发性流产、习惯性流产、先兆流产及妊娠剧吐等合并症史；(2)由其他疾病引起的便秘，如肠梗阻，炎症性肠病等；(3)有明显心血管、呼吸、消化、血液、内分泌、神经或精神等疾病；(4)患者实验期间使用其它影响疗效药物、 出现严重不良反应不能坚持参与实验或失访者，视为退出病例。28例妊娠期便秘患者年龄20～35岁、平均(28.34±6.13)岁，孕周20～26周、平均(25.46±4.32)周，病程7～14 d、平均(12.65±4.89)d。

1.2 方法

1.2.1治疗方法 所有患者均予六味地黄汤药方(火麻仁30 g，熟地黄、桑椹子、山药、肉苁蓉、玄参、麦冬各15 g，山茱萸、茯苓各10 g，砂仁和炙甘草各6 g)治疗，加水750 mL/剂，浸泡30 min，煎至250 mL，1次/d，分早晚2次温水送服，持续2周，并嘱患者服药期间清淡饮食、合理运动、忌寒凉、增加富含粗纤维的蔬菜和水果、适量摄入杂粮及保持规律作息等，若发现任何身体不适，立刻停止用药。

1.2.2粪便取样和16S rRNA细菌检测 六味地黄汤治疗前，采用无菌棉签取所有患者清晨自然排出的新鲜粪便50 g置于大便盒中，并将大便盒和冰块置于盒子里共同送至实验室，在实验室分装后放入-80 ℃冰箱保存；服药2周后对患者进行随访并再次留取患者的粪便。采用 QIAamp DNA Stool Mini Kit 试剂盒(批号51504，德国QIAGEN)抽提治疗前后粪便样本的总基因组脱氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid，DNA)，通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增获得16S rRNA基因V4标签片段，构建Illumina平台文库，并于Illumina平台测序。

1.2.3肠道菌群样本生物信息分析 采用高通量测序技术分析菌群的变化，使用v1.8.0 定量分析微生物生态学(quantitative insights into microbial ecology，QIIME)软件将操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)代表序列与Greengenes数据库(v132)比对注释；根据OTU分析结果，进行Alpha多样性指数分析；采用Chao1指数计算菌群丰度，采用Shannon和Simpson指数计算菌群多样性，同时对OTU表格进行稀释，并绘制稀释曲线。通过从每个样本中随机抽取一定数量的序列，可以预测样本在一系列给定测序深度下所可能包含的物种总数及其中每个物种的相对丰度[11]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 稀释曲线分析

所有患者在治疗过程中无明显不良反应，无退出研究的病例。从稀释曲线可得知，随着样本量的加大，曲线表现为上升趋势，说明有大量的物种被发现；曲线逐渐趋于平坦，说明测序数据量合理；基本能覆盖样本中所有的细菌种类，可以用于后续分析。见图1。

2.2 肠道菌群丰度和多样性

治疗后妊娠期便秘患者肠道菌群的Chao1指数高于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)，但Shannon指数和Simpson指数的差异均无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 治疗前后肠道菌群的丰度和多样性Fig.2 Comparison of abundance and diversity of intestinal flora before and after treatment

2.3 菌群的门、属分类

治疗前后，患者肠道菌群在门水平中均以bacteroidetes、firmicutes和proteobacteria均为高丰度优势菌群，但治疗前后菌群相对丰度比较，差异无统计学意义(P>0.05，图3)；在属水平进行分析，治疗前后共有30个菌群丰度发生改变，治疗前妊娠期便秘患者肠道菌群相对丰度排前5的菌属分别为bacteroidetes、faecalibacterium、prevotella_9、subdoligranulum及lachnospira，治疗后相对丰度排前5的菌属分别为bacteroidetes、prevotella_9、faecalibacterium、blautia及lachnoclostridium(图4)。通过LefSe技术分析寻找有显著差异性的菌属，结果显示经过六味地黄汤治疗后，妊娠期便秘患者粪便菌群中共有10个菌属丰度发生明显改变，Escherichia、alistipes、parabacteroides、bacteroidesfragilis及coprococcus菌属丰度较治疗前明显降低，Faecalibacterium、roseburia、bifidobacterium、prevotella及lactobacillus菌属丰度较治疗前升高，差异均有统计学意义(P<0.05，图5)。

图3 治疗前后肠道菌群在门水平的高丰度物种分布Fig.3 Distribution of high abundance species of intestinal flora at portal level before and after treatment

图4 治疗前后肠道菌群在属水平的物种相对丰度分布Fig.4 Relative abundance distribution of intestinal flora at genus level before and after treatment

图5 治疗前后肠道菌群LefSe分析Fig.5 LefSe analysis of intestinal flora before and after treatment

3 讨论

肠道菌群已成为当今医学与生命科学研究的热点领域，它与人体健康息息相关，在参与消化吸收、抵抗致病微生物定植、促进免疫系统发育等方面均发挥着重要作用[12]。众多研究表明，肠道菌群失调在功能性便秘的发生发展中起重要作用[13-14]。便秘在祖国医学史上曾记载为“大便难”、“后不利”等[15]。《素问·阴阳应象大论》曰：“阴在内，阳之守也；阳在外，阴之使也”。说明阴与阳之间相互促进、相互制约、相互消长，维持着相对的动态平衡[16]。同理，肠道优势菌群与致病菌群之间，也存在相互制约又相互依存的关系，共同维持肠道微生态动态平衡[17]。传统医学认为，肝主藏血，主疏泄，与胆相表里，肠道菌群比例失调，致病菌数量增加，从而产生内毒素，使肝脏负荷加重，最终导致肝脏功能受损；肾主藏精，主水，主纳气，与膀胱相表里，而肾脏功能受损，体内的废物不能排出，停留在血管内，随着血液运行到肠壁血管，进入肠腔，进而影响肠道微生态菌群，打破其平衡状态[18]。六味地黄汤为肝、脾、肾三阴并补之剂，治以滋补肾阴为主，补泻结合，开合相济[19]。

本研究采用Chao1、Shannon和Simpson指数来反映肠道菌群的丰度及多样性，发现经六味地黄汤治疗前后，妊娠期便秘人群的肠道菌群在丰度有明显差异，多样性上暂未发现明显改变，说明六味地黄汤能改善菌群的相对丰度，但肠道菌群的组成结构也具有其稳定性，同一物种的菌群组成是相对恒定的。上述结果与既往对功能性便秘患者肠道菌群的研究不一致。黄林生等[11]探讨慢性功能性便秘患者与健康人群之间肠道菌群的差异，发现2组人群的菌群丰富度有显著差异，而菌群多样性无明显差异。余莉等[20]研究发现老年人群与青年人群的菌群物种多样性相似。各研究结果不同的原因在于：(1)研究对象不同，各研究对象在年龄、生活和饮食习惯等方面存在差异；(2)研究采用的分子生物学技术不统一，或研究采用的干预方式不一致。

本研究分析了妊娠期便秘患者经六味地黄汤治疗前后菌群在门水平和属水平的主成分分布差异，发现在门水平中均以bacteroidetes、firmicutes和proteobacteria为高丰度优势菌群，且治疗前后菌群的相对丰度差异无统计学意义(P>0.05)。在属水平中，治疗前后均以bacteroidetes、prevotella_9 及faecalibacterium菌属为主，共有30个菌属发生改变。进一步通过LefSe技术分析发现经过六味地黄汤治疗后，妊娠期便秘孕妇粪便菌群中共有10个菌属丰度发生明显改变。其中escherichia、alistipes、parabacteroides、bacteroidesfragilis、coprococcus菌属丰度较治疗前明显降低，faecalibacterium、roseburia、bifidobacterium、prevotella、lactobacillus菌属丰度较治疗前升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。众所周知，lactobacillus和bifidobacterium是公认的益生菌，escherichia则是最常见的致病菌。Nabi等[21]发现服用含lactobacillus的制剂能显著改善便秘患者的排便状况。国外一项Meta分析发现与健康人群相比，肠易激综合征患者的bifidobacterium水平明显降低[22]。Wang等[23]在洛派丁胺诱导的便秘动物模型中发现，bifidobacteriumadolescentisCCFM669、667可通过黏附在肠上皮细胞，产生丙酸、丁酸等来缓解便秘症状，同时治疗后乳酸杆菌含量明显增高，而梭菌属含量降低。Wang等[24]通过动物实验研究发现lactobacillusreuterii和lactobacillusaci-dophilus菌群能够促进肠道的蠕动，而escherichia则抑制肠道蠕动。Escherichia菌属作为与消化道症状最为相关的菌属，其对“肠-脑”轴的影响也最大。Philip等[25]通过健康人群粪便样品分析，得出产生γ-氨基丁酸的途径和escherichia菌属活跃表达密切相关。以上这些研究结论与本研究结论类似。Leonardo等[26]研究发现，功能性便秘人群的bacteroides、faecalibacterium、alistipes、lachnospira及coprococcus菌属比健康人群丰度多；黄林生等[11]比较慢性功能性便秘与健康成年人群肠道菌群的差异，发现bacteroides、parabacteroides等菌属在便秘病人的肠道中丰度增多，而prevotella_2及prevotella_9等菌属在正常人群的肠道菌群中丰度增高。但Zhu等[27]研究发现prevotella菌属丰度在便秘人群中下降，firmicutes丰度升高，而bifidobacterium和lactobacillus丰度却没有出现降低。这个结论的不一致，考虑可能是因地域、标本采集部位、实验对象及检测方法等不同。

综上所述，妊娠期便秘孕妇经六味地黄汤治疗后，其肠道菌群发生一定改变，以益生菌的相对增多和致病菌的相对减少为主。同时从侧面说明，六味地黄汤在治疗妊娠期便秘上发挥了有效作用。