杆状体肌病的临床与病理学特征及超微结构特点

许秀丽，刘健，石剑宽，侯庆霞，李青，徐玉乔

杆状体肌病(NM)是一种罕见的以严重肌无力和运动障碍为特征的神经肌肉疾病。因为在患者的肌纤维中发现大量线状或杆状物质而得名，由 Shy等[1]于1963年首次报道。我国目前的报道尚不足20例。随着对NM认识的不断提高，发现杆状体不仅见于NM，还可见于其他累及肌肉的疾病如线粒体脑肌病、肌营养不良、多发性肌炎及皮肌炎等肌肉组织中[2-3]，故本病不能仅仅通过光镜就进行诊断。NM具有广泛的临床表现，肌无力程度轻重不等[4]，根据1999年欧洲神经肌肉病中心(ENMC)的分型标准[5]，NM主要分为6型：(1)重度先天性NM型，占 16.1%，出生时即有严重的肌无力，无法进行自主呼吸，死亡率极高；(2)轻症型，即经典型，占46.1%，婴儿期或儿童期起病，运动发育迟缓，病情相对稳定；(3)中间型，占20.3%，较重度先天性NM症状稍轻， 通常无法独立行走，可以通过呼吸支持维持生命；(4)儿童或青少年起病型，占13.3%；(5)成人起病型，占4.2%；(6)其他类型NM。NM患者CNS通常不受影响，智力正常，通常最终死于呼吸衰竭。本研究报道4例NM患者，总结其临床、组织病理学、超微结构及遗传学的相关特点，以提高临床及病理医师对本病的认识。

1 临床资料

1.1 一般资料

1.1.1 病例1 男，18岁，因“进行性四肢无力、萎缩十余年”入院。患者十余年前无明显诱因出现双下肢无力，奔跑不能，双上肢力量减弱，握力减少，家人发现患者症状逐渐加重，四肢及躯干肌肉明显萎缩，双下肢呈“鹤腿”样，手部精细动作姿势异常，站立及行走困难。EMG检查示：(1)双正中、腓及右尺运动神经受损(双腓神经明显)；(2)左肱二头肌及右股四头肌肌源性损害。肌酸激酶62 IU/L，肌酸激酶同工酶23 IU/L。患者患有先天型“双足马蹄内翻畸形”。

1.1.2 病例2 女，14岁，为例1妹妹。因“四肢无力，行走费力十余年”入院。患儿十余年前出现四肢无力，近端明显，尚能提轻物、抬臂梳头等。行走慢，行走时臀部向两侧摆动，易跌倒，卧床起立时须先转为仰卧位，蹲下起立时需按压膝部辅助。面部表情少，不能吹口哨，鼓腮困难，发音含糊。上述症状缓慢加重，逐渐出现脚尖着地，足部加压固定后方能行走，无明显肌痛，无明显肌萎缩，智力正常。EMG诱发电位示:(1)双腓及右正中运动神经波幅偏低；(2)被检肌不除外肌源性损害。肝功能、肾功能、心肌酶及电解质均正常。

1.1.3 病例3 男，1岁11月，因“运动发育落后8月余”入院。8个多月前患儿家长发现其运动发育落后，表现为不能独站，不会爬，不能独走，平素易流口水，予补充钙剂及维生素D治疗半年。父母否认近亲结婚。EMG诱发电位示：四肢肌可见肌源性损害改变。神经肌肉发育基因包检测：ACTA1基因c.821>T(p.A274V)杂合变异。肝功能、肾功能、心肌酶及电解质均正常。

1.1.4 病例4 男，21岁，因“步态异常10年，加重半年”入院。患者10年前无明显诱因出现步态异常，表现为脚外侧先着地，体育运动比同龄人差，同时伴有四肢肌肉萎缩。于当地医院行“臀肌挛缩”手术，术后改善不明显。半年前症状加重，出现上楼梯费力，蹲下起立困难，自觉右下肢无力明显，无肌肉疼痛等不适。EMG诱发电位示：上肢三角肌，下肢股四头肌，腓肠肌示肌源性病变；肌酶示：肌酸激酶260 IU/L，余未见异常。

1.2 病理学研究及基因检测结果

1.2.1 光镜观察结果 前2例患者采用开放性左侧肱二头肌活检，后2例患者采用开放性右腓肠肌活检。部分新鲜肌肉标本经液氮冷却的异戊烷速冻处理,恒冷切片机切片，切片厚约 8 μm，分别行HE，MGT、PAS及油红O特殊染色，还原型辅酶Ⅰ-四氮唑还原酶(NADH-TR)酶组织化学染色；部分肌肉标本经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续切片行免疫组化EnVision 两步法染色，所用免疫组化染色抗体为抗线粒体、抗肌萎缩蛋白(Dystrophy1, Dystrophy2)、CD4、CD8、CD20和CD68。光镜观察显示，4例患者肌纤维直径大小不一，部分肌纤维变性，病例3部分肌纤维萎缩；肌纤维内及肌纤维膜下均可见粗颗粒样或杆状物质沉积， HE染色呈略红染(图1A、1D、1G、1J), MGT染色呈暗紫色(图1B、1E、1H、1K)。杆状体所在区域NADH-TR染色显示酶活性紊乱，且部分病例显示Ⅰ型肌纤维略占优势(病例1、2和4)。免疫组化染色结果显示，肌纤维抗肌萎缩蛋白DYS1和DYS2阳性，抗线粒体染色小灶弱阳性，而油红O特殊染色和 PAS糖原染色均未见明显异常。病例1、病例2和病例4 的多数肌纤维内出现暗紫色微小杆状颗粒，NADH-TR染色显示Ⅰ型肌纤维略占优势；病例4还有少许炎细胞浸润(主要是巨噬细胞)；病例3可见少许肌纤维内暗紫色杆状及点状物质沉积，NADH-TR染色显示Ⅰ、Ⅱ型肌纤维分布大致正常，未见群组化或小角肌纤维等神经源性肌损害改变，MGT染色显示未见破碎红纤维等线粒体异常等改变。

1.2.2 电镜观察结果 另取部分新鲜肌肉标本经4.0%(质量浓度)戊二醛固定、1%(质量浓度)锇酸固定，超薄切片，行铅-铀双染色，置透射电镜下观察。电镜结果显示，4例患者可见肌纤维粗细不等，在肌膜下或部分肌纤维内(图1C、1F、1I、1L)可见多个高电子密度的杆状小体，形态与大小不一，与Z线电子密度一致，走行与肌纤维长轴平行，与Z线垂直；长约1～5 μm，宽约0.3～1 μm。病例3的杆状小体数量较其余3例少。前2例部分区域肌膜下线粒体及糖原颗粒略有增多，线粒体嵴形态尚正常，后2例部分区域糖原颗粒增加。杆状体可与Z线相连，或增粗呈短棒状，杆状体聚集区域肌原纤维走行较紊乱，杆状体的排列也不规则。

1.2.3 基因检测结果 病例3患儿采集外周静脉血2 ml，委托公司利用高通量测序完成，并利用Sanger测序验证。结果显示，ACTA1基因存在1个杂合突变：c.821>T(p.A274V)。

图1 NM的光镜及电镜特点 图A～C 、D～F 、G～I、 J～L分别代表病例1、病例2、病例3及病例4(染色从左到右依次为HE染色、MGT染色、电镜图片)。HE染色显示肌纤维内及肌膜下均可见略红染粗颗粒样或杆状物质沉积(图A、D: ×400; 图G、J: ×200)，其中病例3可见部分肌纤维萎缩伴脂肪组织增生(图G)，病例4部分肌纤维内可见巨噬细胞浸润伴空泡形成(图J)； MGT染色显示肌纤维胞浆中出现暗紫色微小杆状或颗粒样物质沉积(图B、E、H、K)，其中图H(病例3)暗紫色物质数量较少(图H:200×，图B、E、K:×400)；电镜下显示肌膜下及肌纤维内有多个高电子密度的杆状小体，与 Z线电子密度一致(图C、F、I、L；C、L: ×9 900，图I: ×12 000)，图F放大显示杆状小体长约1～5 μm，宽约0.3～1 μm(图F: ×20 500)

2 讨 论

NM是一种少见的常染色体显性或隐性遗传性肌病，可由多种基因突变所导致。本研究4例患者均属于经典型NM，在婴儿期或儿童期起病，运动发育落后，站立及行走困难，易跌倒，蹲下起立困难，面部表情少，进行性四肢无力，出现肌肉萎缩，EMG示肌源性损害改变。其中前两个患者为亲兄妹，具有家族遗传特征，哥哥还患有先天型“双足马蹄内翻畸形”。国内去年曾报道1例家族遗传性病例，母女以四肢对称性肌无力为首发症状，最终诊断NM 6型[6]；国外曾报道1例患儿和其母亲及姥姥三代显性遗传[7]，尚未见文中类似家族性兄妹共同发病的报道。

NM主要病因为编码细肌丝相关蛋白的基因突变。目前发现可能的致病基因有13种[8]。NEB基因变异是NM最常见的原因，约占已发现致病基因的50%，ACTA1是NM第二常见致病基因(15%～25%)，其它致病基因较为罕见[9]。ACTA1突变已发现200余种，主要为错义突变，90%导致显性疾病和10%导致隐性疾病。NEB突变通常是隐性遗传的，但最近第一个显性遗传突变在NEB中被发现，引起NM的远端病变[10]。Sewry等[11]指出由于这些基因分型和上述分类中的表型相关性较少，建议重新修订，如最近研究发现LMOD3相关的NM患儿由于病情较重，在产前会出现羊水过多和胎动减少，可能为该疾病提供产前诊断线索[12]。病例3的ACTA1基因存在1个杂合突变：c.821>T(p.A274V)，是ACTA1基因从头合成的新的变异，与肌无力有关，目前报道很少。尽管具体机制尚不清楚，但Pula等[13]曾报道1例3岁NM患儿ACTA1的新型变异可引起线粒体呼吸链复合物1的活性降低。

杆状体并不是NM所特有的，也可见于炎症性肌病、慢性进行性肌营养不良、其他类型先天性肌病等多种类型的骨骼肌疾病。只有在肌纤维胞浆内、肌膜下出现大量的杆状体，方视为NM的特征性病理改变。本病常见的鉴别诊断包括多发性肌炎、皮肌炎等炎症性肌病，线粒体脑肌病及慢性进行性肌营养不良如强直性肌营养不良等肌病。多发性肌炎和皮肌炎属于炎症性肌病，临床表现以肌痛、肌酸激酶的显著增高为特征，其肌酶增高程度可高达正常数十倍以上。肌活检可见多灶性、数目不等的炎细胞浸润，以淋巴细胞和巨噬细胞为主，皮肌炎还伴有明显的皮损以及特征性肌周束肌纤维萎缩等，糖皮质激素治疗往往效果显著[14]。本研究中病例4的肌酸激酶轻度升高且有少量炎性细胞浸润，余3例正常，但肌活检中光镜及免疫组化CD68、CD4、CD8和CD20等炎细胞标记染色均提示炎症表现轻微且患者无肌痛及特征性皮疹等皮肌炎的症状，与炎症性肌病不符。线粒体脑肌病是一组线粒体结构和功能异常所致的以脑和肌肉受累为主的多系统疾病，临床表现以肌肉无力为主，运动后乳酸特征性升高[15]，电镜下显示线粒体堆积及形态异常。本研究中4例均无运动后乳酸增高，且2例虽然电镜下局灶区域线粒体略有增多但形态未见异常，不符合线粒体脑肌病的诊断标准。强直性肌营养不良为成人较常见的慢性进行性肌营养不良性肌病，多为成人期起病[16]，先天性肌强直可于幼儿期起病。本研究中4例患者虽然肌纤维粗细不等，部分肌纤维萎缩，但并未出现强直性肌营养不良所显著的核内移、肌浆块、肌巨细胞及链条核等肌萎缩的特征。免疫组化抗肌萎缩蛋白染色显示肌纤维DYS1和DYS2阳性，亦可除外Duchenne型肌营养不良和Becker型肌营养不良等其他慢性进行性肌营养不良性肌病。需强调的是，如果观察到肌纤维胞浆内、肌膜下大量的杆状体聚集可视为本病的特征性病理改变，如果所取材的骨骼肌组织较少或杆状体数目较少时(如病例3)，行特定的基因检测是必要的。

对于婴儿期或儿童期起病且病程较长的肌无力患者，需考虑肌肉疾病尤其是先天性肌病可能，除了行常规的肌肉光镜及电镜病理检查，必要时还需行基因检测以明确诊断。NM无特效治疗，应注意心肺功能监测，当出现呼吸、吞咽困难或呼吸道感染时给予对症处理，呼吸衰竭可呼吸机治疗。随着基因研究成果增多，将来基于基因的治疗可能是最有成效的[17]。