鼠实验性牙周炎复合模型建立的研究进展

冯源，王柳杨，任念念 综述 葛颂 审校

遵义医科大学，贵州 遵义 563000

牙周炎是一项牙周组织发生慢性破坏的感染性疾病[1]，本质上是一种混合细菌感染，最终导致牙齿松动、脱落[2]。牙周炎是人类广泛患有的疾病且发病率高，与全身系统性疾病息息相关[3]，其治疗方案有待进一步研究。适合的牙周炎动物模型有助于研究人牙周炎的病因及病理改变，适用于研发药物，最终运用于临床的疾病治疗及预防中。

1 常用牙周炎模型动物

灵长类动物的口腔构成与人最为相似，其中猴与人各方面都有较高的相似度，其造成的牙周炎模型也最为接近。但因猴属于自然保护动物，价格昂贵且繁殖较慢，在大规模实验研究中的应用受到较大的限制[4]。

犬牙周炎模型与人相似，其中比格犬在国外应用广泛，但犬类品种间的差异较大，影响其易感性，且犬的攻击性、饲养、病变程度和部位不均匀等特点也造成了其应用受限[5]。

兔口腔微生物菌群分布与人类较为相似，因其臼齿为单根，较少用于牙周炎模型的建立，常用于骨相关的研究[6]。

小型猪在与全身性疾病相关的模型建立中效果上佳[7]，也是理想的自发性牙周炎实验模型，但价格较高、饲养复杂，目前应用较少。

鼠饲养成本较低，有足够的数量进行研究和统计分析，生命周期短，适应能力及抗病能力强，可快速诱发疾病，是目前应用最广泛的动物[8]。

2 鼠牙周炎复合模型的建立

2.1 牙周炎伴动脉粥样硬化鼠模型 心脑血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的病理基础为动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)。牙周炎和动脉粥样硬化的复合模型通常采用两个或者两个以上相结合的方案。(1)高脂饮食+腹腔注射维生素D3+磨牙结扎+口腔接种牙周致病菌复合模型：任秀云等[9]对SD大鼠行一次性腹腔内注射维生素D3，高脂饲料比例逐渐增大喂养，15周后免疫组化染色，成功建立动脉粥样硬化模型；丝线缠绕结扎丝再以“8”字结扎鼠的磨牙，定期口腔涂布牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)，15周后出现牙周炎临床表现，成功建立牙周炎模型。张源明等[10]同上法注射维生素D3、高脂饲料喂养，免疫组化染色观察动脉血管壁，成功建立AS模型；丝线结扎双侧磨牙，每3周接种1次由4种牙周炎致病菌标准菌的混悬液(P.g、A.a、F.n、P.i，1×109CFU/mL)于大鼠龈沟内，建立牙周炎模型。大鼠临床牙周检查以及病理检查显示牙周炎动物模型建立成功。(2)基因敲除小鼠+口腔接种牙周致病菌复合模型：CHUKKAPALLI等[11]采用4种牙周致病菌(P.gingivalis、T.denticola、T.forsythia和F.nucleatum，2.5×109CFU/mL)口腔灌洗ApoE-/-小鼠，第24周时处死小鼠，以牙槽骨吸收情况确定牙周炎的形成，以病理检查确定动脉内膜明显斑块形成，牙周炎动脉粥样硬化小鼠模型建模成功。目前，AS模型建立中普遍应用基因敲除小鼠，但以此建立牙周炎模型较为困难，因其牙齿小，口内结扎操作极为不便且效率较低；研发出基因敲除大鼠或其他较大型实验动物将更有利于日后的模型建立及研究[12]。

2.2 糖尿病 糖尿病为一项广泛存在的长期、慢性疾病，现普遍认为，糖尿病与牙周炎之间的关系是双向的，即一种疾病的存在往往会增加另一种疾病发生的风险和严重性，反之亦然[13]。牙周炎和糖尿病复合模型通常采用多种相结合的方案。(1)高糖饮食+腹腔注射链脲佐菌素+正畸丝结扎+丝线结扎结扎复合模型：高脂饲料加10%高糖水喂养大鼠两周，之后行腹腔注射链脲佐菌素(40 mg/kg)，血糖高于16.7 mmol/L，糖尿病建模成功；糖尿病牙周炎组用丝线缠绕结扎丝置于磨牙颈部，5 d后有明显的牙周炎临床症状，可见牙根暴露[14]，判断牙周炎造模成功。(2)自发性T2DM大鼠模型+磨牙结扎+口腔接种牙周致病菌复合模型：OLETF为自发性T2DM大鼠，LETO为其对照组；通过制作4种牙周病原体的混悬液，将丝线浸泡后进行磨牙结扎，并每隔四周口内行牙周致病菌混悬液涂抹，20周后处死所有大鼠，micro-CT和病理切片确定其牙周炎形成[15]。OLETF大鼠作为优秀的T2DM动物模型，结合涂菌的丝线结扎能成功建立牙周炎模型。糖尿病常用药物链脲佐菌素等诱导产生，其操作方便，成功率较高，但不一定反映的是T2DM真实本质的病理状态,因而影响研究结果的可靠性。OLETF大鼠临床表现和病理变化与人类T2DM极为相似。是目前国际上公认的最理想的2型糖尿病的动物模型之一。但其费用较高，购买过程较繁琐，临床尚需更合适的动物模型。

2.3 阿尔茨海默症(Alzheimers disease，AD) 阿尔茨海默症是一种慢性神经退行性疾病，脑组织中的β淀粉样蛋白沉积、tau蛋白过度磷酸化、神经元丢失及炎症反应为特征性病理改变。流行病学研究发现牙周炎是阿尔茨海默症的危险因素，牙周致病菌如牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌等已在脑脊液及神经节中获得分离，致病菌将自身毒性及产出的毒力因子直接作用于脑内[16]。牙周炎和阿尔茨海默复合模型方案如下：(1)APP转基因小鼠+口腔接种牙周致病菌复合模型：从J20品系获得雌性半合子转基因小鼠(hAPP-J20)和非转基因小鼠(WT)；于小鼠口内龈边缘涂布含牙龈卟啉单胞菌的羧甲基纤维素，对照组仅涂布同量羧甲基纤维素。11周后micro-CT和组织病理学检测其牙周炎模型造模成功，通过新奇物识别实验对其认知功能进行评价，判断其AD形成[17]。(2)诱导Aβ沉积+磨牙结扎复合模型：麻醉雄性SD大鼠，固定其于立体定位仪中，注射Aβ25-35于海马体附近，缝合切口，丝线缠绕钢丝结扎大鼠上颌双侧第二磨牙。饲养一段时间后，水迷宫实验(MWM)显示实验组学习和记忆能力较差；光学显微镜观察H＆E染色的脑组织切片，发现实验组海马CA3区受损神经元的数量较高，出现磨牙明显的牙周临床症状，AD及CP模型造模成功[18]。目前阿尔茨海默病病因的假说和理论较多，尚无定论，因此动物模型的方法尚多，能在不同方面印证某一假说或理论，但目前没有一项动物模型及造模方法可完全模拟人类的老龄化过程及阿尔茨海默病发生过程中的病理变化。分析不同模型特点及其表现优势，从不同致病机制综合分析多项模型的实验结果，能够更真实地追溯阿尔茨海默病的病因。

2.4 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA) 类风湿关节炎是一种以关节内的炎症发生以及周围硬组织的破坏为主要临床表现的自身免疫性疾病[19]。关节炎与牙周炎都有遗传学背景,相似病理过程表现为病变部位的慢性炎症并伴随骨的吸收和破坏。牛Ⅱ型胶原诱导RA+口腔接种牙周致病菌复合模型：7周龄，体质量18~20 g DBA/1型雄性小鼠分为单纯胶原诱导类风湿关节炎组(CIA)和P.g感染+胶原诱导RA组(CIA+P.g)。CIA：口腔内涂抹2%羧甲基纤维素；CIA+P.g：口腔内2 d一次接种含牙龈卟啉单胞菌(P.g)的羧甲基纤维素，1周后胶原诱导RA：尾部注射0.1 mol/L(胶原：100μg)乳剂。免疫后10 d行二次加强免疫，小鼠出现四肢关节肿胀，RA建模成功[20]。上述提到的各种复合模型的建立受时间、操作便捷性等影响，方法数目有限。但单一模型的建立方法仍有许多，文中尚未提及，是否能组合成为新的复合模型建立方法仍有待探索。

2.5 不同品系鼠的造模差异 实验动物大鼠的常用品系为Wistar大鼠、Got-Kakizaki(GK)大鼠、Brown-Norway(BN)大鼠、Sprague-Dawley(SD)大鼠[21]，口腔常用为Wistar大鼠和SD大鼠，其造模后呈现的效果不尽相同。周颖芳等[22]分别用SD大鼠和Wistar大鼠Ⅱ型胶原诱导构建关节炎模型(CIA)，炎症指数评分和病理改变均显示SD大鼠关节炎症重于Wistar大鼠，提示在建立CIA复合模型时可优先选择SD大鼠。董亚南[23]在SD、Wistar大鼠最大摄氧量的增龄特征与运动强度的定量化研究中发现相同年龄阶段Wistar大鼠运动能力表现优于SD大鼠，品系选择对AD大鼠的行为学试验表现、COPD大鼠肺功能检测结果的影响应纳入考虑范围。郭学军等[24]腹腔注射STZ分别建立SD、Wistar大鼠糖尿病模型，发现Wistar大鼠成模率和死亡率均高于SD大鼠，选用中剂量(55 mg/kg)给药则可以有效提高SD大鼠成模率，降低其死亡率；陈枫等[25]则发现以35 mg/kg给药可增高Wistar大鼠的成模率，其结果优于SD大鼠。吕晓君等[26]用改进的高热量饲料建立了SD和Wistar大鼠肥胖模型，品系间未见明显差异。C57BL/6J小鼠较ICR和KM更能形成良好肥胖模型[27]。通过高脂饮食诱导方式分别给予Balb/c、C57BL/6，后者更易产生具有差异的体质量增加；在糖代谢方面，前者出现代谢功能异常，而后者则无[28]。上述结果对建立糖尿病复合模型或动脉粥样硬化复合模型具有一定参考意义。

3 鼠牙周炎相关模型的建立

非正常的咬合接触关系或者咬合力过大导致的咀嚼系统各部位的病理性损害或者适应性变化被称为咬合创伤[29]，咬合创伤可作为一项独立疾病，也可作为牙周炎的一个重要的局部促进因素，尚无定论。其造模方法如下：(1)降低两边牙齿咬合+丝线结扎法复合模型：BUDTZ-JØGENSEN等[30]适量磨去雄性Wistar大鼠第二、第三磨牙的牙尖，以不引起牙髓炎、不暴露牙髓为标准来造成双侧第一磨牙咬合力过大；选取任一侧下颌第一磨牙颈部棉线结扎,另一侧不做处理。30 d后牙周炎合并创伤模型建立。组织学显示根分叉病变，牙槽骨嵴顶明显降低。(2)放置高嵌体+脂多糖注入牙龈法复合模型：YOSHINAGA等[31]于大鼠牙龈左下第一磨牙龈沟内注入脂多糖形成牙周炎模型，然后在对牙放置一高嵌体，致使左下第一磨牙形成创伤，成功形成牙周炎合并咬合创伤的复合模型。(3)螺纹钉+Keyes2000牙周炎饲料加自身粪便水喂养复合模型：大鼠左侧上颌第一磨牙面中央窝处用车针形成一孔，再植入螺纹钉，使其高出面0.6~0.8 mm，以此造成对创伤。病理切片结果中对牙根、牙槽骨表面破骨细胞数目及牙槽嵴高度降低情况显示其牙周炎状况，对此进行分析[32]。

4 结语

牙周炎作为一项广泛发生的疾病，威胁着人类的健康。以鼠为模型，对牙周炎的致病机制、牙周炎与其他疾病的关系进行研究，获得了大量的数据和新的进展。但鼠的口腔微生物和人口腔微生物不同，其实验结果有待进一步的分析及临床试验的支持。以鼠为模型的动物实验已证实或推翻了研究者的部分设想，其实验结果为研究牙周病的发生发展、其与全身疾病的关系、临床治疗等方面提供了新的思路和方向，也是牙周医学的发展的重要推动力之一，实验性牙周炎鼠模型的研究也将继续发挥其重要作用。