环状RNA在消化系统肿瘤疾病中的研究进展

林旭东，鞠少卿

(1.南通大学，江苏 南通 2.南通大学附属医院医学检验科，江苏 南通 )

与传统的线性RNA分子不同，环状RNA circRNA(Circular RNAs,circRNA)是一类以共价键形成环形结构的非编码RNA分子，不同于其他ncRNA，其缺少5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴，并且其表达更稳定，不易被Rnase降解。1976年研究者首次在植物类病毒中发现circRNA[1]，并发现其广泛存在于真核细胞生物中。近年来尤其是2012年之后随着高通量核酸测序技术的广泛运用，许多原来未知的circRNA分子序列渐渐浮出水面。近些年来，对circRNA的研究呈现出了井喷的模式。虽然人们对于其功能并未得到真正的了解，但多项研究表明了circRNA在人类疾病尤其是肿瘤发生发展中发挥重要作用。

1 circRNA的特征

circRNA广泛存在于哺乳动物细胞中并由已知的蛋白质基因编码表达，circRNA主要分为三类，分别是外显子circRNA、内含子circRNA、以及外显子-内含子circRNA，其主要由多个或单个外显子组成[2]，You[3]等发现了circRNA尤其在哺乳动物大脑中含量较为丰富，其缺乏多聚腺苷酸[poly(A)]尾巴和帽子(capping)结构，circRNA定位于细胞质中并广泛存在，与形成一般外显子的线性和开放的5'-3'结构的传统线性剪接不同，circRNAs包含共价闭合和末端缺失的环状结构。近些年来随着研究的不断深入，circRNA在疾病中的作用被逐渐揭开了面纱。

2 circRNA的主要功能

circRNA大量存在于真核细胞生物体内，虽然近些年来有大量报道，但其研究一般都只停留在表面，还未真正弄清其具体机制。以下主要从充当“miRNA海绵”、与RNA结合蛋白(RBPs)结合、调节基因表达发挥生物学功能、以及编码蛋白质这4个主要方面进行阐述。

2.1circRNAs作为miRNA“海绵”:miRNA“海绵”是circRNA研究最多的一种功能。circRNA通过竞争结合相关的miRNA，影响该miRNA对靶mRNA的作用[4]。许多circRNA具有多个miRNA的结合位点并同时调节它们，这些进化上保守的结合位点可确保与靶miRNA结合的效率。Wei[5]的研究中发现CircCDYL在肝癌患者血浆中高表达，其机制是通过海绵化MiR-892a以及MiR873-3p。

2.2circRNA通过调节基因发挥生物学功能:位于细胞核的一些circRNA存在U1 snRNA结合位点，可以形成RNA-蛋白复合物，并与启动子区域的RNA聚合酶Ⅱ结合，顺势调控亲本基因的转录。Zhang[6]等研究发现ci-ankrd52在细胞核中含量丰富而对microRNA靶位点的富集很少，其可以通过结合ankrd52基因转录的Pol Ⅱ直接调控ankrd52基因的表达，敲除该基因后可以下调其亲本基因的表达。

2.3circRNA与RNA结合蛋白结合:circRNA可以和RNA结合蛋白结合来参与调控多种生物学功能，包括细胞增殖、分化、运动、调亡和衰老等。Circ_ZKSCAN1通过竞争性结合FMRP蛋白发挥其抑制肝细胞性肝癌组织的增值。Memczak[7]等研究证明了人类circRNA-ciRS-7转录物能与AGO蛋白(argonaute,AGO)密集结合，并形成了一大类转录后调控因子。

2.4circRNA参与蛋白质的翻译:由于circRNA缺少5′的帽子结构和3′末端的poly(A)尾巴，所以一直被认为是无翻译功能的。近年，发现一些circRNA是可以编码蛋白质的，其原因可能是circRNA中富含甲基化修饰的腺嘌呤，而这种甲基化修饰，它可以发挥像内部核糖体进入位点序列同样的作用，促使circRNA翻译合成蛋白质[8]。CircPPP1R12A在结肠癌组织中的表达显著增高，其原因可能是circPPP1R12A[15]携带一个开放阅读框(ORF)，该ORF编码一个功能蛋白circPPP1R12A-73aa。

3 circRNA在消化系统肿瘤中的研究

近年来有关circRNA在人类疾病中的研究呈现出爆发式的增长，近年来研究发现circRNA分子与多种疾病的发生、发展以及转归都有密切的关系，circRNA在消化系统肿瘤中能直接参与调节其病理的发生发展过程[9]，鉴于其特殊的结构，在血清中的存在更加稳定，因此也更有潜力作为疾病的诊断标志物。消化系统分为消化道和消化腺，消化道包括口腔、咽、食道、胃、结直肠、肛门等部，其主要功能是进行食物机械性的消化，是食物暂时储存的场所，并在其中进行消化和营养物质的吸收。消化腺主要包括唾液腺、肝脏和胰脏，其参与食物的化学性消化，其中含有多种消化酶，帮助食物的消化。目前我国居民病死率最高的恶性肿瘤中[10]，消化系统肿瘤占据着4位，它们分别是肝细胞癌、胃癌、食管癌和结直肠癌。

3.1circRNA在消化腺体肿瘤中的研究进展

3.1.1circRNA与肝细胞肝癌(HCC):肝细胞肝癌是我国十大肿瘤之一，发病率以及病死率都位居肿瘤疾病的前列。目前虽然随着临床技术的不断提高，比如手术切除、移植等方法的改进，早期肝癌的治愈率和生存率得到了较大的提高，5年生存率达到了40%～70%，但由于大部分肝癌发现都到晚期，导致了这部分患者的预后较差[11]。近年来，越来越多的研究发现了circRNA在HCC的发生发展中起着重要的作用，可以作为潜在的诊断和治疗靶点。通过高通量测序以及实时荧光定量PCR等方法，越来越多的circRNA在肝细胞肝癌中的作用机制被广泛研究。Zhang[12]等的研究发现由脂肪细胞摄取的外泌体circRNA可以促进肿瘤的生长，其主要机制是通过抑制miR-34a并激活USP7/Cyclin A2信号通路。circRNA cSMARCA5在HCC组织中表达下调，并且与侵袭性特征显著相关，是肝癌患者肝切除术后总生存率和无复发生存率的独立危险因素。Yao[13]阐明了circ_0001955通过海绵化miR-516a-5p来释放TRAF6和MAPK11的表达，促进了HCC的肿瘤发生。Circ_RHOT1通过招募TIP60启动NR2F6的表达来抑制HCC的发展和进展，提示circ_RHOT1可能成为HCC预后的潜在生物标志物。Zhang[14]等研究又发现了circ_TRIM33-12在肝细胞肝癌中表达下调且与恶性特征显著相关，是影响HCC患者术后总生存(OS)和无复发生存(RFS)的独立危险因素。近些年来circRNA在肝细胞肝癌中的研究日益增多，越来越多的circRNA在肝癌中的作用机制被逐渐阐述，也为寻找高敏感度和特异性的肿瘤标志物提供了越来越多的证据。

3.1.2circRNA与胰腺癌:胰腺癌具有恶性程度高、早期诊断困难、预后较差等特点，并且其远处转移的比例较高，达到90%[15]。2015年我国胰腺癌发病率位居第9位，死亡率达到了第6位[16]。由于胰腺癌的早期症状并没有特异性，导致了很多患者就诊时已到晚期，从而失去了最佳的手术机会。在胰腺癌中最多见的类型是胰腺导管腺癌(PDAC)。近年来，很多研究者设法从circRNA中寻找出较为敏感和特异的标志物。在Zhu[17]的研究发现胰腺癌组织中hsa_circ_0006215显著上调。Li[18]研究circ-IARS表达与胰腺癌的转移关系，发现了其与肝转移、血管浸润、肿瘤淋巴结转移分期呈正相关，与术后生存时间负相关。Yang[19]等又发现了circ-LDLRAD3在胰腺癌组织以及病人血清中的表达比健康对照者更高，同时与CA19-9联合检测，对于胰腺癌的诊断特异性以及敏感度将显著提高，而circ-LDLRAD3的敲除也能抑制胰腺癌的转移，其机制是通过miR-137-3p/PTN轴的调控。胰腺癌的恶性程度极高，这些circRNA的发现有助于给胰腺癌的诊断，能提灵敏度和特异性，但其具体机制还需要进一步阐明。

3.2circRNA在消化道肿瘤中的研究进展。

3.2.1circRNA与食管癌:食管癌(ESCC)在肿瘤发病率中位居世界第八位，并且是肿瘤性疾病的第六大死因，最常见的病理类型是鳞状细胞癌[20]。其五年生存率不足20%，也严重影响着患者的生存质量，为此，人们设法寻找出具有敏感性和特异性较高的肿瘤标志物。hsa_circ_0067934被发现在食管鳞状细胞癌中高表达，并且其肿瘤细胞分化越差，其表达也就越高。Hu[21]等证明了circGSK3表达上调与ESCC患者的晚期临床和不良预后呈正相关。检测血浆中circGSK3表达可用于ESCC和早期ESCC诊断，曲线下面积分别为0.782和0.793，具有较高的诊断效能，可能作用一种新型的肿瘤标志物。Liu[22]的研究显示circRNA_100367通过miR-217/Wnt3途径增强KYSE-150R细胞的抗辐射能力。在体外，circRNA_100367沉默降低了辐射下KYSE-150R细胞的生长Wang等[23]研究发现在ESCC细胞、血浆和组织中circ-TTC17表达水平明显升高，体外实验表明，circ-TTC17可促进ESCC细胞的增殖和迁移。食管鳞状细胞癌由于其恶性程度较高，病人有进行性吞咽困难等症状，对病人生活质量有较大的影响，而只依靠临床常规检查，较难在早期发现，因此寻找具有高灵敏度和特异性的标志物显得尤为紧迫，circRNA由于其特殊的结构和广泛的存在而得到关注，为寻找新型食管癌标志物提供了可能。

3.2.2circRNA与胃癌:胃癌(GC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，其肿瘤的发病率和死亡率分别排名第五位以及第三位[24]。胃癌的发生是一种多种因素、多细胞、多阶段的过程，诸如不良的饮食习惯、幽门螺杆菌感染都是导致胃癌发生的因素。近年来，研究主要集中在胃癌的诊断和预后中，一些致癌或抑癌的circRNA在胃癌中被逐步证实，其主要机制是通过海绵化microRNA(miRNA)。不同的circRNA在胃癌细胞和组织中表达有差异。CIRS-7是研究较为深入的circRNA之一，通过拮抗miR-7介导的PTEN/PI3K/AKT通路起重要作用的致癌circRNA，CIRS-7的高表达可以减少miR-7诱导的细胞凋亡。Wang[25]等研究发现circLMTK2在GC组织中表达上调，circLMTK2的高表达与不良预后相关，其机制是通过海绵化miR-150-5p，从而间接调控c-Myc表达，促进GC肿瘤发生。Huang[26]等同样发现hsa_circ_0000745在胃癌组织中表达下调，组织分化越差，同样在胃癌患者的血浆样本中较健康对照组表达下调，表达水平越低，淋巴结转移程度越高，血浆hsa_circ_0000745、癌胚抗原(CEA)联合检测，使AUC达到0.775，说明其联合应用具有良好的诊断效能。由于circRNA广泛的存在、稳定性、保守，其作为胃癌的潜在标志物成为了可能。

3.3circRNA与结直肠癌:结直肠癌(CRC)是最常见的恶性肿瘤之一,它具有容易复发和转移等特性，其发生是多种因素的综合，比如年龄、肥胖、不健康的饮食、缺乏运动等。因此CRC对于人类的健康构成了较大危害。考虑到传统的治疗手段的缺点，比如化疗药物的毒性以及耐受性，临床治疗的效果依然很难达到满意。

circRNA在结直肠癌中的研究也日益增多，Shang[27]等研究揭示了环状PACRGL通过miR-142-3p/miR-50 6-3p-TGF-β1轴促进大肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，以及对N1-N2中性粒细胞的分化，同时也揭示了circRNA_PACRGL在大肠癌细胞存活和转移中的致癌作用。Chen[28]等在最近的研究中也发现了circRNA_CTNNA1作为miR-149-5p的海绵，在体内外均可以促进结肠癌细胞的增殖，同时也与结肠癌的进展呈正相关，过度表达也提示了circRNA_CTNNA1大肠癌细胞的G1/S期转变，表达增高的结肠癌患者的肿瘤体积和质量显著增加。低氧是导致很多实体肿瘤的一个方面，体外的circ-133来自于缺氧细胞，并通过作用于miR-133a/gef-H1/RhoA轴而进入常氧细胞并促进结直肠癌细胞的转移。Xu[29]等发现了circRNA_0001178、circRNA_0000826在CRC组织中表达显著上调。并且提示circRNA_0001178和circRNA_0000826可能作为结直肠癌肝转移的潜在诊断生物标志物。Yuan[30]等研究发现circ_0026344表达水平与结直肠癌进展及淋巴结转移呈负相关。circ_0026344低表达预示CRC患者预后不良，其机制可能是海绵化miR-21和miR-31，circ_0026344的表达水平与CRC组织中miR-21和miR-31的表达水平呈负相关。结直肠癌的发病率近年来有持续提高和年轻化的趋势，circRNA的发现为结直肠癌寻找具有高灵敏度和特异性的标志物提供了可能。

4 小结与展望

近年来由于消化系统肿瘤的发病率比较以往有很大的增高，而由于其普遍具有高复发率易转移等特点，其预后不甚理想，早期发现以及做出诊断就显得尤为重要。因此需要寻找敏感性和特异性较高的肿瘤标志物。circRNA由于其结构稳定，不易被降解，含量较高等多种因素而成为了被研究的热门，有些文献也报道了和传统的肿瘤标志物联合检测能显著提高对某一种肿瘤疾病的诊断效能。然而其应用也要依赖于细胞组织，还不能单独应用在血清等容易获得的临床样本中，并且circRNA与肿瘤的具体机制也需要进一步阐明。随着进一步深入的研究，circRNA有望成为特异性和敏感性较高的肿瘤标志物。