钝化材料对农田土壤Cd形态及微生物群落的影响

兰玉书，袁林，杨刚，程蓉，石梏岐，高本汗

（1.四川农业大学环境学院，成都 611130；2.四川省生态环境科学研究院，成都 610041；3.四川农业大学生态环境研究所，成都611130；4.中国地质科学院矿产综合利用研究所，成都 610041）

土壤作为人类的生存之本，不仅是农业生产最基本的生产资料，同时也是生态系统各种环境污染物主要的源和汇[1-2]。据《全国土壤污染状况调查公报》显示，我国耕地土壤点位超标率达19.40%，重金属污染尤为突出。镉（Cd）是常见的重金属污染物之一，具有迁移能力强、毒性大、易被植物吸收等特点，过量的Cd会抑制农作物生长发育，降低产量，进入食物链后，对生物体造成极大的威胁[3-4]。因此如何利用轻度Cd污染土壤安全生产农作物成为研究的关键。固化修复技术通过向污染土壤中添加钝化剂从而降低重金属的流动性和生物可给性，具有破坏性小、成本低且安全的特点[5-6]。石灰、海泡石作为目前运用较为广泛的钝化剂，对降低土壤重金属有效性有良好的效果[7-8]。研究表明，污染农田中施用石灰可明显降低水稻秸秆和谷物及蔬菜中重金属的积累[9-10]。袁兴超等[11]运用海泡石（45 t·hm-2）钝化处理铅锌矿区周边Cd、Pb污染农田，Cd钝化效率可达36.5%。此外生物炭以环境友好且经济性高的优势而被推广，相关研究表明生物炭不仅能为土壤增加养分，其疏松多孔的结构，还能对重金属产生强大的吸附作用[12-13]。大田试验研究显示施加钙基改性生物炭，土壤中有效态Cd的降幅达12.00%～30.20%[14]。另有研究表明叶面喷施适量微量元素肥料能够提高植物营养，促进植物生长并降低重金属对植物的危害[15]。金华等[16]研究表明纳米螯合铁肥在重金属Cd污染农田治理中有良好的潜力，能够有效降低植物对Cd的吸收。

目前，大多数的研究集中于钝化剂对土壤重金属形态的影响以及重金属在植物中的迁移情况，而土壤中的微生物群落作为土壤重要组成部分比植物更具敏感性，被认为是衡量土壤生态功能的重要指标，研究表明施加钝化剂会导致微生物群落功能响应发生变化[17]。杨胜香等[18]发现在铅锌尾矿废弃地土壤添加不同碳氮磷源改良剂对土壤微生物群落组成、多样性、微生物活性和微生物生物量均有显著性影响。Xu等[19]研究发现，生物炭的加入增加了土壤中微生物生物量，改变了土壤的微生物群落结构。

对此，本研究在轻度Cd污染土壤农田中开展原位钝化试验，探讨4种广泛运用的钝化材料（海泡石、石灰、生物炭及螯合铁肥）对土壤Cd形态、生态风险及微生物群落的影响，以期进一步为钝化修复轻度Cd污染农田土壤提供理论支持和实践经验。

1 材料与方法

1.1 试验地基本情况

试验田位于四川省攀枝花某农田（101°24′30.51″E，26°59′8.24″N），土壤类型以渗育型水稻土为主，土壤基本理化性质见表1。与《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618—2018）标准值相比，该农田土壤属于轻度Cd污染。

1.2 供试材料

供试钝化剂：海泡石（HP）、石灰（SH）、秸秆生物炭（SW）和螯合铁肥（TF），均购于国药集团化学试剂有限公司。各材料中Cd含量分别为0.25、0.08、0.33 mg·kg-1和0.03 mg·kg-1。

供试水稻品种为超级杂交水稻德优4727（DY），由四川省农业科学院提供。

1.3 试验设计

试验于2017年4—11月开展，试验设置如下：CK处理为不添加任何钝化剂；HP处理为添加海泡石1.12 kg·m-2；SH处理为添加石灰0.15 kg·m-2；SW处理为添加秸秆生物炭1.12 kg·m-2；TF处理为添加0.2%螯合铁肥。每个处理设置3个重复，随机排列，共设计15个小区（3 m×9 m）。其中，HP、SH处理和SW处理为水稻幼苗移栽前人工撒施钝化材料，TF处理为水稻灌浆期，分两次喷施于水稻叶面。

2017年4月开始在未受污染的土壤中进行水稻育苗，水稻幼苗移栽前5 d，将HP、SH处理和SW处理试验小区所需的海泡石、石灰和生物炭采用人工撒施方法均匀施入对应小区，翻耕混匀（深度20 cm）并平整土地。水稻育苗完成，采集并选取长势一致、健康的水稻幼苗进行移栽，水分管理与传统种植方式一致。TF处理组在水稻进入灌浆期后，分两次将0.2%螯合铁肥喷施于水稻叶面。2017年9月上旬收获水稻并采集样品。

1.4 样品采集及测定

土壤样品于水稻成熟期采集，在各试验小区采集至少5个点的0～20 cm层土壤，混匀，挑出植物残体和石块后，采用四分法装袋。一部分新鲜土样装于封口袋放于冷冻箱储存，用于分析微生物相关指标；另一部分样品储存于自封袋内并转移至实验室通风处进行自然风干，磨细，过筛后分别装袋，标记待用。

表1 土壤基本理化性质Table 1 Physical and chemical properties of the experimental soil

土壤pH采用电位法测定[20]；土壤基本理化性质参考《土壤农化分析》测定[20]；土壤重金属形态分级采用BCR连续提取法提取[21]，ICP-MS测定；重金属Cd全量采用HNO3-HF-HClO4消解，ICP-OES测定，以GBW07428（GSS-14）作为质控，该土壤标样为四川盆地土壤，Cd定值为0.20±0.02 mg·kg-1，试验测量值为0.18 mg·kg-1。

土壤微生物测定：样品按照DNA试剂提取样品基因组DNA，进行PCR扩增，基于Illumina HiSeq测序平台，利用双末端测序（Paired-End）的方法，构建小片段文库进行测序。

1.5 土壤污染评价方法

生态风险系数是综合反映重金属对生态环境影响潜力的指标[22]。潜在生态危害程度分级标准见表2。

式中：Cf为污染系数；F1为可交换态Cd含量，mg·kg-1；F2为可还原态Cd含量，mg·kg-1；F3为可氧化态Cd含量，mg·kg-1；F4为残渣态Cd含量，mg·kg-1；Er为单一重金属潜在生态风险指数；Tr为重金属的毒性因子，Cd的Tr取值为30[23]。

表2 潜在生态危害指数Er标准Table 2 Standard for grading of potential ecological risk index

2 结果与分析

2.1 钝化剂对土壤理化性质的影响

处理组pH值与对照组相比均有所增加，其中HP和SW处理组显著升高，分别增加1.29、0.44个单位。处理组pH值由大到小依次为HP＞SW＞SH＞TF（表3）。土壤有机质及N、P、K含量是衡量土壤肥力的重要指标，研究结果显示，HP处理组有机质含量显著增加37.15%，其余处理组变化未达到显著水平；SW处理组速效K显著增加，与对照组相比含量增加103.92%；HP与SH处理组速效P含量分别显著降低29.54%、40.85%，其余处理组变化不显著。

2.2 土壤Cd形态及生态风险变化

钝化剂对土壤重金属Cd含量及Cd形态的影响如图1所示。与对照组相比，SH处理组土壤中的Cd含量下降3.09%，HP、SW和TF处理组均有所增大，分别增加5.95%、3.77%、4.03%，但Cd含量变化并未达显著水平。

对照组中重金属Cd的可还原态占比最多（0.35 mg·kg-1，43.33%），其次是可交换态（0.31 mg·kg-1，39.28%）、残渣态（0.11 mg·kg-1，13.28%）及可氧化态（0.03 mg·kg-1，4.11%）。钝化处理后各组土壤中Cd的可交换态与对照组相比降低了29.79%～64.48%，降幅比例由大到小依次为 HP＞SW＞SH＞TF。SH、HP、SW、TF处理组与对照组相比，可氧化态含量分别增加79.86%、57.87%、62.50%、159.72%，残渣态含量分别增加57.82%、171.83%、101.79%、86.11%。

土壤中潜在生态风险系数（Er）揭示了土壤中Cd的危害程度，结果如表4所示。对照组Cd的Er值为195.84，表明具有高潜在生态风险。其余处理组与对照组相比，Er值均降低，SH、SW、TF处理组Cd的Er值介于80～160，由高潜在生态风险降为较高潜在生态风险。HP处理组Cd的Er值为58.02，为中度潜在生态风险（表4）。钝化剂的施用显著降低了土壤Cd的生态风险。

表3 钝化处理对土壤理化性质的影响Table 3 Physical and chemical properties of the soils of different treatments

图1 钝化处理对土壤Cd总量及赋存形态的影响Figure 1 Effects of different passivators on total Cd and Cd fractions in paddy soil

2.3 钝化剂对土壤微生物群落多样性的影响

不同钝化处理下土壤微生物的OTUs数和群落多样性指数的变化情况见表5。各处理高通量测序覆盖率均大于99%，反映本次测序结果样本中物种被检测出的覆盖率高。总体来看，施加钝化剂增加了HP、SH和SW处理组群落的多样性，但TF处理组的OTUs数及群落多样性指数均出现下降。从微生物群落丰富度来看，TF处理组的ACE和Chao1指数分别降低2.26%、2.07%，其余各组均有所增加，从大到小依次为SH＞SW＞HP。从微生物群落多样性来看，TF处理组的Shannon指数下降5.50%，其余各组均有所增加。Shannon指数增幅最大的为SW处理组，其次为SH处理组。

表4 土壤重金属Cd生态风险评价Table 4 Ecological risk assessment of Cd in soil

土壤细菌门的相对丰度结果显示：优势菌门包括变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和绿弯菌门（Chloroflexi），相对丰度占比68.56%～77.60%（图2）。在所有处理中，变形菌门占比最高，为31.53%～39.83%。其次为酸杆菌门和放线菌门，分别占比13.18%～18.26%和10.35%～14.34%。所有土壤中均发现芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、螺旋体菌门（Saccharibacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿菌门（Chlorobi）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae），但相对丰度较低。施加钝化剂后，各处理组变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门丰度均增加，芽单胞菌门、绿弯菌门、螺旋体菌门相对丰度均降低。HP处理组的酸杆菌门和放线菌门相对丰度降低，其余各组增加。

基于Beta多样性分析，使用R语言工具绘制的PCoA分析结果见图3，第一主成分（PC1）对样品差异的贡献值为50.73%；第二主成分（PC2）对样品差异的贡献值为29.13%，表明土壤微生物群落结构组成受到不同钝化处理的影响较大。其中SW、HP和SH组距离较近，说明此3个处理组微生物群落结构较为相近，而距离较远的对照组及TF处理组微生物群落结构差异较大。通过物种丰度聚类热图（图4）可知，SW与HP聚在一起，这两者又与SH聚类在一起，TF相距最远，该结果证实了上述PCoA的分析结果，且由图呈现结果可以看出不同钝化剂的施用使某些微生物群落得到抑制或增强。

表5 不同处理土壤微生物群落功能多样性指数的变化Table 5 Changes in the functional diversity indices of the soil bacterial communities in the different treatments

图2 钝化剂对水稻根际细菌门水平平均相对丰度的影响Figure 2 Effects of different amendments on the main phyla average relative abundance of rice rhizosphere bacteria

图3 不同处理微生物群落PCoA分析Figure 3 Principal coordinates analysis（PCoA）of bacterial communities in the soils from different treatments

图4 不同钝化处理细菌门水平物种丰度聚类热图Figure 4 Heat maps of different amendments on the main phyla abundance of bacteria

土壤微生物群落多样性与理化性质相关性分析结果如表6所示，pH与OTUS、ACE和Chao1指数显著正相关，与Shannon呈正相关；有机质、碱解N、速效P及速效K与微生物群落多样性指标均无显著性相关，且相关性较低；Cd与ACE和Chao1指数显著正相关，与OTUS及Shannon呈正相关，但生态风险系数（Er）与各微生物群落多样性指标均呈负相关关系。进一步分析各样品及微生物群落与不同形态Cd之间的关系（图5），RDA分析结果显示，各Cd形态之间的关系表现为残渣态分别与可还原态和可氧化态呈正相关，而可交换态与其余3种形态均为负相关，尤其与残渣态呈显著负相关。土壤细菌门与Cd形态的关系为拟杆菌门和变形菌门与可交换态呈显著负相关，芽单胞菌门、螺旋体菌门和放线菌门与可交换态呈正相关。

表6 土壤微生物群落多样性与土壤理化性质相关性分析Table 6 Correlation analysis between soil bacterial ecological diversity and soil physical and chemical properties

图5 不同处理微生物群落组成的冗余分析Figure 5 Redundancy analysis of bacterial community composition in different treatments

3 讨论

3.1 钝化剂对土壤理化性质和Cd形态的影响

使用碱性改良剂原位修复重金属酸性污染土壤是一种成熟且有效的方法[24]。钝化剂的施加一定程度上改变了土壤理化性质，尤其显著提高了土壤pH，且施加生物炭具有增强土壤肥力的优势。研究结果显示，施加钝化剂后土壤重金属Cd略有增加，但未达到显著水平。推测一方面是由于施加的钝化剂含有重金属Cd（0.03～0.33 mg·kg-1），另一方面由于大气沉积致使重金属Cd不断进入土壤。此外，由于不同处理中地表径流和浸出率不同，导致土壤中Cd累积量有所不同[25]。因此实际运用中选用钝化材料不仅需要考虑经济性、钝化效果，同时还需兼顾其对生态环境的潜在风险。

土壤中Cd总量并不能反应生态风险的影响，分析土壤中Cd不同形态具有重要意义。土壤中的可交换态Cd易被植物直接吸收，可还原态和可氧化态Cd在一定条件下能转变为可交换态，能够间接被植物吸收[26-27]。研究显示，施用钝化剂使得可交换态Cd向可氧化态和残渣态转化，其含量显著降低。土壤pH值对重金属形态有显著影响，提高土壤pH能够降低土壤重金属的有效性和迁移能力，其原因是pH影响着土壤重金属的溶解-沉淀平衡[28-29]。研究结果显示HP处理组土壤Cd的可交换态降幅最大，为64.48%。由于海泡石具有比表面积大、吸附性强的特点，能有效吸附土壤重金属[30]。曹雪莹[31]研究表明，向Cd污染酸性红壤中施加0.5%的海泡石使土壤Cd有效态浓度降低了53.10%，这与本研究结果一致。SW处理组土壤Cd的可交换态下降33.71%。生物炭同样具有比表面积大的特点，此外，其表面含有大量官能团可与土壤中重金属络合而显著降低重金属生物有效性[32]。

3.2 钝化剂对土壤微生物群落及多样性的影响

不同钝化剂对土壤微生物群落产生不同的影响，这可能是由于钝化剂能够抑制或增强特定的微生物群落。TF处理组中土壤微生物群落的多样性和丰度均降低，说明螯合铁肥不利于微生物群落的生长。SW处理组的土壤微生物多样性在各处理中最高，但丰度较差。已有研究表明，生物炭的应用提高了微生物的养分利用率，从而使微生物的丰度和活性得到提高[33]。SH处理组微生物群落丰度均有所提高且ACE和Chao1指数均最大。

在细菌群落组成上最丰富的是变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线 菌门（Actinobacteria）和 绿 弯菌 门（Chloroflexi）。这与其他研究结果类似，这些菌群常出现于重金属污染土壤，属于核心菌群，表明这些细菌群可能为耐金属的生物体[34-35]。研究结果显示，土壤中的变形杆菌门相对丰度最大，施加钝化剂后增加0.75%～23.69%。许多研究报道变形杆菌门对重金属污染不敏感，能够在重金属浓度较高的环境中生存[36-37]。一般认为，酸杆菌门嗜酸，不利于在碱性环境中生存[38-39]。而本研究结果显示，添加钝化剂后土壤pH值增加，酸杆菌门相对丰度也有所增加，与该结论矛盾。但也有研究发现在中性、碱性的环境中检测出酸杆菌的基因序列，并表示酸杆菌门的相对丰度与土壤中多种环境因子相关[40-41]。推测该现象可能与酸杆菌对土壤环境因子响应存在差异有关[42]。此外，土壤中的厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度在施加钝化剂后有所增加，厚壁菌门主要存在于适当的环境中[43]。因此，随着重金属Cd生态风险的降低，厚壁菌门相对丰度在增加。

大量研究表明，土壤微生物受多种环境因素影响，这些因素包括土壤理化性质、土壤酶活性、重金属等[18，34，44]。本研究结果显示，pH 与微生物群落功能多样性指数显著相关，说明该因素对微生物群落影响较大，而土壤营养物质对微生物群落的影响并不明显。在多个研究中均得出pH是影响微生物群落的关键因素，主要由于pH能够影响多种环境因素，包括土壤重金属形态、营养物质及酶活性[45-47]。也有研究表明有机质是微生物的主要能量和营养来源，与微生物之间存在显著的相关性[47-48]。但在本研究中并未得到此结论，推测该现象是由于土壤中有机质含量相对较低，因此可在农业种植过程中适当补充营养物质，更有利于土壤微生物的生长发育。此外Cd含量是影响微生物群落的另一要素，Xiao等[47]的研究中指出在重金属污染的地区，微生物对金属胁迫产生了耐受性，从而导致了微生物多样性的增加[48-49]。微生物长期在Cd污染的土壤中对污染土壤逐渐适应，耐性微生物逐渐增多，所以在一定浓度的污染范围内Cd与微生物丰度及多样性出现了正相关关系。在相关性分析中发现Cd的生态风险指数（Er）与微生物群落多样性指数负相关，说明微生物群落多样性受Cd形态的影响。通过RDA分析结果得知Cd不同形态对优势菌门影响有所不同，当重金属形态产生变化会导致微生物群落结构发生变化。

4 结论

（1）与对照组相比，施加钝化剂使土壤pH增加0.17～1.29，土壤中可交换态Cd降低29.79%～64.48%，土壤中的Cd由可交换态向可氧化态和残渣态转化。施加钝化剂能降低土壤中重金属Cd的生态风险。

（2）施加海泡石、石灰、秸秆生物炭土壤微生物多样性和丰度均有所增加，但螯合铁肥降低了土壤微生物OTUs数、微生物多样性和丰度，不利于微生物群落的生长。

（3）施加不同钝化剂改变了土壤微生物群落组成，各处理组变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）丰度均增加，而绿弯菌门（Chloroflexi）、螺旋体菌门（Saccharibacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）相对丰度均降低，pH和Cd是影响微生物群落的关键因素。