基于双荧光基团分子信标对水体中铅离子（Ⅱ）的检测

2021-01-05熊威威张应坤鲁子敬汪鹏翟琨向东山

农业环境科学学报 2020年12期

熊威威，张应坤，鲁子敬，汪鹏，翟琨*，向东山*

（1.湖北民族大学生物资源保护与利用湖北省重点实验室，化学与环境工程学院，湖北恩施 445000；2.恩施职业技术学院，湖北恩施 445000）

铅（Pb）是一种严重危害人体健康的重金属元素，是三大重金属污染物之一[1]。Pb具有良好的延展性、柔软性和耐腐蚀性等特性，因而被广泛地应用于冶金、蓄电池、印刷、颜料、油漆等工业与生活用品中[2]。但随着含Pb物质使用的逐渐增加，大量的含Pb化合物随着生活污水、工业废水、工业废料及生活垃圾进入大自然中。由于含Pb化合物在自然条件下不能被降解[3]，并可在生物体中进行富集，因此Pb可直接或间接地进入人体，对人体健康造成危害。据报道，Pb进入人体可损伤神经系统及大脑，还可引起婴幼儿脏器发育不全及贫血等疾病，严重威胁人类健康[4]。因此，对于Pb的检测具有十分重要的意义。

目前对Pb2+的常用检测方法有比色法[5-6]、紫外-可见分光光度法[7]、电化学分析法[8]、火焰原子吸收光谱法[9]和电感耦合等离子体质谱法[10]等。但这些方法有的检测灵敏度较低，有的重复性不好，有的需要昂贵的仪器，因此，建立一种简单快速、特异性好、灵敏度高、适用于常规检测Pb2+的方法具有较强的现实意义。

分子信标（Molecular beacon）是一种具有茎-环结构的双标记的寡核苷酸荧光探针，它具有很强的特异性和较高的灵敏度，现已广泛应用于生物学、医学、环境科学及食品科学等领域[11-13]。核酸适配体（Aptamer）是一种经体外筛选得到的、对相应靶标分子（如蛋白质，核酸、病毒，药物分子、重金属离子等）有严格识别能力和高度亲和力的寡核苷酸序列。据报道，Pb2+的核酸适配体已被筛选出来（核酸中的G碱基能与Pb2+形成稳定的G-四联体空间结构）并应用到Pb2+高选择性的检测中[14-16]。目前基于Pb2+核酸适配体及分子信标对Pb2+的定量检测已有一些应用，但检测过程较为复杂，不适合快速的常规检测[17-18]。

为了简化Pb2+定量检测的步骤，加快其检测速度，同时提高检测的灵敏度，本实验基于Pb2+的核酸适配体[19]，设计了一个能特异性识别Pb2+的双荧光基团分子信标，利用分子信标直接对Pb2+进行检测，建立了一个Pb2+的快速常规检测方法。该分子信标由能发生荧光共振能量转移的两个荧光基团（FAM和TAMRA）代替经典分子信标中的一个荧光基团和一个猝灭基团，与FAM相连接的3个核苷酸中都含有鸟嘌呤（G碱基），分子信标的环及茎的一部分设计为Pb2+的核酸适配体。在这个分子信标中，TAMRA既是一个荧光基团，又是一个猝灭基团，它本身能发射荧光，同时又可以对一些荧光基团的荧光进行猝灭。FAM的发射光谱与TAMRA的吸收光谱有重叠，所以当荧光基团FAM和TAMRA靠近时，FAM的荧光能被TAMRA所吸收。另外，G碱基在荧光共振能量转移中可以通过光诱导电子转移的方式猝灭TAMRA所发射的荧光，且具有很好的猝灭效果[20]。因此，在该分子信标中，FAM的荧光能被TAMRA所猝灭，TAMRA的荧光能被G碱基所猝灭，在没有Pb2+存在时，FAM和TAMRA的荧光信号都很弱。当分子信标与Pb2+反应后，分子信标的茎-环结构被破坏，FAM与TAMRA、TAMRA与G碱基彼此分开，距离增加，荧光共振能量转移及光诱导的电子转移消失，FAM与TAMRA的荧光同时得到恢复。根据FAM与TAMRA荧光恢复的程度即可实现对Pb2+的定量检测。

与目前已有的基于分子信标及核酸适配体对Pb2+的定量检测方法相比，本方法利用分子信标直接与Pb2+反应实现对Pb2+的检测，简化了Pb2+定量检测的步骤，加快了检测速度。另外，本方法所构建的分子信标在对Pb2+进行定量检测时能产生两个不同的荧光响应信号，利用TAMRA与FAM的总荧光强度对Pb2+进行定量分析，可显著提高检测的灵敏度。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

实验所用仪器包括RF-5301PC型荧光光谱仪（日本Shimadzu公司），PHS-3C pH计（中国上海仪电科学仪器股份有限公司）。Pb（NO3）2试剂为优级纯（型号：GR500G），其他所有化学试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司（中国）；实验所用的缓冲溶液为0.1 mol·L-1的Tris-HNO3缓冲溶液；分子信标由上海生工生物技术有限公司（中国）合成并用高效液相色谱法进行纯化，其碱基序列为：5′-FAM-（CH2）6-GGG AAA CCA CTG GAA GGT GTG GAA GGT TTC CC-（CH2）6-TAMRA-3′（斜体部分为Pb2+核酸适配体的碱基序列）。

1.2 样品制备

分子信标用0.1 mol·L-1的Tris-HNO3缓冲溶液（pH 8.3，含60 mmol·L-1的NaNO3）稀释成浓度为3×10-7mol·L-1的储备液，Pb（NO3）2用蒸馏水配制成不同浓度的溶液备用。将50 μL不同浓度的Pb（NO3）2溶液加入到50 μL 3×10-7mol·L-1的分子信标溶液中混合均匀，在45℃的水浴锅中加热12 min，冷却至常温后，加入Tris-HNO3缓冲溶液至终体积达到500 μL，在室温下反应35 min，然后对体系中FAM及TAMRA的荧光信号进行检测。除非文中特别指明，本研究中所有样品的测定条件均与以上条件保持一致。

1.3 水样的取样与消化

自来水取自湖北民族大学基础化学实验教学示范中心实验室，天然矿泉水取自湖北恩施龙洞河源头，河水取自湖北恩施龙洞河三孔桥处（离源头3 km处，途经一个医院和一所高校），取样时间均为2020年7月5日中午。采水过程中所用的简易采水器和盛水容器均为聚乙烯材质，采集自来水时先放水5 min再进行取样，天然矿泉水和河水的取样均使用洗净的简易采水器，润洗3次后在水深20 cm处采集水样，水样带回实验室后冷藏保存，并于当日完成测定。所取水样清彻透明，无色、无悬浮杂质和沉淀。消化时，移取水样100 mL于消化罐中，加入5 mL浓HNO3溶液，然后置于温控板上加热，温度设为90℃。待样品蒸发至体积约为10 mL时，再加入5 mL浓HNO3与2 mL浓HClO4溶液，再次加热至体积为1 mL左右。重复上述步骤，直至溶液澄清透明为止。将最终样品冷却至室温后，用0.45 μm滤膜过滤，然后转移至100 mL容量瓶中，用2%的硝酸溶液定容。

1.4 Pb2+的检测

Pb2+的检测通过对反应后体系中FAM及TAMRA的荧光信号进行检测来实现，本实验采用同步荧光分析法对FAM及TAMRA的荧光信号进行检测。荧光基团FAM最大激发波长为494 nm，最大发射波长为520 nm，荧光基团TAMRA的最大激发波长为559 nm，最大发射波长为582 nm，它们的斯托克斯位移（Stokes shift）分别为26 nm与23 nm，为了同时满足FAM及TAMRA荧光信号的测定，同步扫描的波长间隔（Δλ）设置为25 nm，荧光分光光度计的激发及发射狭缝宽度均设置为10 nm。所有荧光强度的数值均在FAM或TAMRA的最大发射波长处测得。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

检测Pb2+的原理如图1所示，荧光基团FAM连接在分子信标的5′端，与FAM相连接的3个核苷酸中的碱基均为G碱基，另一个荧光基团TAMRA连接在分子信标的3′端，分子信标的环及茎的一部分设计为Pb2+的适配体（GGA AGG TGT GGA AGG）。没有Pb2+存在时，分子信标为茎-环结构，FAM与TAMRA的荧光信号都很弱。当有Pb2+存在时，分子信标与Pb2+反应形成稳定的G-四联体结构，分子信标的茎-环结构被破坏，FAM与TAMRA的荧光同时得到恢复。在分子信标过量的前提下，Pb2+的浓度越大，与Pb2+结合的分子信标就越多，FAM与TAMRA的荧光信号就越强。根据FAM与TAMRA荧光增加的程度，即可实现对Pb2+的双色荧光定量检测。

2.2 方法可行性分析

图2为分子信标与不同浓度的Pb2+反应后，体系中荧光基团TAMRA与FAM所对应的荧光光谱图。从图2可以看出，当没有Pb2+存在时，TAMRA与FAM的荧光信号都很弱（图2a），但加入不同浓度的Pb2+后，TAMRA与FAM的荧光信号都显著增强，且Pb2+的浓度越大，它们的荧光信号也越强。这说明利用该方法对Pb2+进行定量检测是可行的。

图1 基于双荧光基团分子信标检测Pb2+的基本原理Figure 1 Principle of detection for Pb2+based on dual-fluorophore molecular beacon

图2 不同浓度的Pb2+体系所对应的同步荧光光谱图Figure 2 The synchronous fluorescence spectra of system at different concentrations of Pb2+

2.3 实验条件优化

2.3.1 缓冲溶液pH对测定结果的影响

本实验以Tris-HNO3为缓冲体系，探究了缓冲体系的pH对测定结果的影响（图3）。结果表明，缓冲体系的pH在7.4～8.3的范围内时，荧光基团FAM及TAMRA的荧光强度均随着pH的增加而增加；当pH大于8.3时，FAM及TAMRA的荧光强度均随着pH的增加逐渐降低。这说明当缓冲体系的pH较低时（＜8.3），分子信标与Pb2+形成G-四联体结构的稳定性随pH的升高而加强；当pH较高时（＞8.3），分子信标与Pb2+形成G-四联体结构的稳定性随pH的升高而逐渐减弱。因此，本实验选择pH为8.3的Tris-HNO3缓冲体系。

2.3.2 加热时间和温度对测定结果的影响

图3 pH对荧光强度的影响Figure 3 Effect of pH on fluorescence intensity

为了使分子信标与Pb2+更好更快地结合形成G-四联体结构，反应体系进行了加热处理，目的是在加热时使分子信标的茎部打开，在冷却过程中，分子信标更容易与Pb2+特异性结合，形成稳定的G-四联体结构。为了得到合适的加热时间和温度，本实验对加热时间和温度对测定结果的影响进行了考察。

当温度为45℃、加热时间为3～12 min时，FAM及TAMRA的荧光强度均随加热时间增加而增大，当加热时间超过12 min后，其荧光强度基本不变，说明在12 min之内分子信标的茎部即可完全打开（图4），因此本实验孵育时间选择为12 min。

当加热时间为12 min时，考察了温度对测定结果的影响。结果（图5）表明，当温度在35～45℃时，FAM及TAMRA的荧光强度均随温度的升高而增大，当温度高于45℃时，其荧光强度几乎不再变化。因此本实验的加热温度选择为45℃。

2.3.3 分子信标与目标物Pb2+反应时间对测定结果的影响

将分子信标与Pb2+的混合物加热之后，取出冷却至室温，此时分子信标与Pb2+特异性结合形成G-四联体。本实验对分子信标与Pb2+的结合时间进行了考察。结果（图6）表明，在20～35 min内，FAM及TAMRA的荧光强度均随着反应时间的增加而增大，随后趋于稳定。这说明分子信标与Pb2+在35 min内即可反应完成。根据文献[17-18]报道，已有的基于分子信标对Pb2+的检测方法，反应时间都需要60 min以上，因此本方法极大缩短了反应时间，可显著加快Pb2+的检测速度。

2.3.4 缓冲溶液中NaNO3的浓度对测定结果的影响

图4 加热时间对荧光强度的影响Figure 4 Effect of heating time on fluorescence intensity

图5 加热温度对荧光强度的影响Figure 5 Effect of temperature on the fluorescence intensity

图6 反应时间对荧光强度的影响Figure 6 Effect of reaction time on fluorescence intensity

溶液中的阳离子可以中和分子信标的负电荷，使分子信标与Pb2+结合更加稳定[21]，因此溶液中电解质的浓度对测定结果会有影响。本实验通过改变缓冲溶液中NaNO3的浓度，来探讨电解质的浓度对反应体系的影响。结果（图7）表明，当NaNO3浓度在0～60 mmol·L-1时，FAM及TAMRA的荧光强度均随着NaNO3浓度的增大而逐渐增大，当NaNO3的浓度超过60 mmol·L-1时，FAM及TAMRA的荧光强度趋于稳定。因此本实验选择含60 mmol·L-1的NaNO3缓冲溶液。

2.4 工作曲线及检出限

在优化条件下，对不同浓度Pb2+所对应的FAM及TAMRA的荧光强度进行了考察。图8a为不同浓度Pb2+所对应的FAM及TAMRA的同步扫描的荧光光谱图。图8b和图8c分别为FAM及TAMRA在其最大波长处的荧光强度与Pb2+浓度之间的线性关系，图8d为FAM及TAMRA在其最大波长处的荧光强度之和与Pb2+浓度之间的线性关系。结果表明，Pb2+浓度在8×10-10～4×10-8mol·L-1范围内，FAM、TAMRA的荧光强度（ΔI，ΔI=I-I0，I0为体系中没有Pb2+时荧光强度，I为体系中存在Pb2+时的荧光强度）分别与Pb2+的浓度（C）呈现出良好的线性关系，其拟合的回归方程分别为 ΔI1=1.543C+8.953（=0.992 8），ΔI2=1.532C+9.678（R22=0.994 6）。利用FAM、TAMRA的荧光强度对Pb2+进行定量分析时的检出限分别为2.5×10-10mol·L-1及3.0×10-10mol·L-1。另外，TAMRA与FAM的总荧光强度与Pb2+的浓度（C）在8×10-10～4×10-8mol·L-1范围内同样呈现出良好线性关系，其拟合的回归方程为ΔIT=3.052C+13.129（R2T=0.998 7），检出限为1.5×10-10mol·L-1。这说明利用TAMRA与FAM的总荧光强度对Pb2+进行定量分析时，其灵敏度更高（斜率更大）。对9个浓度均为7×10-9mol·L-1的平行样品进行测定，其相对标准偏差（RSD）为3.8%，说明该方法具有较好的精密度。

2.5 方法特异性分析

为了考察方法的特异性，将水体中常见的阳离子及能与Pb2+发生配位或沉淀反应的阴离子分别加入到含Pb2+浓度相同的溶液中，并与只含Pb2+的溶液进行对比实验。在各个浓度均为4×10-8mol·L-1的Pb2+溶液中分别加入浓度为 1×10-5mol·L-1的 Hg2+（Hg）、K+（K）、Na+（Na）、Ca2+（Ca）、Mg2+（Mg）、Mn2+（Mn）、Ni2+（Ni）、Cd2+（Cd）、Cu2+（Cu）、Fe3+（Fe）、Al3+（Al）、Cr3+（Cr）、Cl-（Cl）、Br-（Br）、Ac-（Ac）、SO42-（S）的溶液，在相同的条件下与4×10-8mol·L-1的Pb2+（Pb）进行对比实验。结果（图9）表明，即使在含Pb2+的溶液中加入浓度远大于Pb2+浓度的其他离子，各样品所对应的荧光强度也几乎没有变化，这表明上述离子的存在对Pb2+的检测没有干扰，即该方法对Pb2+具有很高的选择性。尽管有一些阳离子（如K+）也能与含G碱基的分子信标形成G-四联体结构，但据文献[19]报道，当Pb2+与K+同时存在时，Pb2+与G碱基结合形成G-四联体结构比K+与G碱基结合形成G-四联体结构要更稳定，因此K+的存在不会对Pb2+的检测产生干扰，本实验的结果也证明了这一点。另外，尽管水样中还存在其他不同的阴离子，但考虑到分子信标是带负电的，水样中带负电的阴离子与分子信标存在排斥作用[22-23]，不会发生反应，因此本实验只考察能与Pb2+发生配位或沉淀反应的阴离子。

图7 NaNO3浓度对荧光强度的影响Figure 7 Effect of NaNO3concentration on fluorescence intensity

2.6 实际样品检测与加标回收实验

图8 不同Pb2+浓度所对应的FAM及TAMRA的同步荧光光谱图、FAM及TAMRA的荧光强度、FAM和TAMRA的总荧光强度与Pb2+浓度的线性关系图Figure 8 Synchronous fluorescence spectra of FAM and TAMRA at different concentrations of Pb2+，the linear relationships between the fluorescence intensity of FAM，the fluorescence intensity of TAMRA，and the total fluorescence intensity of FAM and TAMRA and the Pb2+concentration，respectively

图9 方法特异性分析Figure 9 Specificity analysis of methods

为了验证方法的实用性，本实验对实际水样中的Pb2+进行了检测，并进行加标回收实验。在自来水、天然矿泉水及河水3种不同类型的水样中，分别取4份相同的水样，加入不同浓度的Pb（NO3）2溶液（表1），消解后各取50 μL按本方法对各样品中的Pb2+浓度进行测定。表1的结果显示，河水、自来水及天然矿泉水水样中Pb的含量分别为2.85×10-9mol·L-1、2.49×10-9mol·L-1及2.24×10-9mol·L-1，均低于国家规定的饮用水Pb2+含量标准。在这3种实际水样中进行加标回收实验，其回收率在96.7%～104.3%，且所取水样测定结果的相对标准偏差都小于5%，这说明本方法在实际样品的检测中具有较高的准确度。

表1 采用本方法分别测定河水水样（Ri）、自来水水样（Ti）与矿泉水水样（Si）中的Pb2+（n=3）Table 1 Determination of Pb2+in river water samples（Ri），tap water samples（Ti）and spring water sample（Si）by this method（n=3）