AMPK通路在骨代谢中调节作用的研究进展

赵雪丹 向茜 杨晶晶 葛林虎 曾素娟

广州医科大学附属口腔医院儿童口腔科/广州市口腔再生医学基础与应用研究重点实验室，广东 广州 510182

腺苷酸激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是由催化亚基α、调节亚基β和γ组成的异源三聚体蛋白，负责维持细胞三磷酸腺苷(Adenosine-triphosphate，ATP)产生与消耗之间的平衡[1]，被认为是一种代谢应激传感酶，在调节细胞和全身能量稳态中起着重要作用。以往研究[2-5]表明AMPK是代谢性疾病、癌症和动脉粥样硬化的治疗靶点，在抗炎、抗肿瘤、延缓衰老等治疗中也起到重要作用。目前骨质疏松症被认为可能是类似糖尿病、肥胖症的另一种能量代谢性疾病，而AMPK可调节成骨细胞分化和骨形成[6]，提示AMPK信号通路有望在骨质疏松疾病的骨代谢中发挥关键作用。本文拟对AMPK激动剂、抑制剂、AMPK通路在骨代谢中的作用及AMPK成骨的机制作一综述。

1 AMPK激动剂、抑制剂

1.1 AMPK激动剂

目前，已知的AMPK经典活性药物激动剂主要有阿卡地新(Acadesine，AICAR)、噻吩吡啶酮(A-769662)和二甲双胍。其中，前两者为直接激动剂，二甲双胍为间接激动剂。AICAR可被细胞摄取，在腺苷激酶(Adenosine kinase，AK)的磷酸化作用下形成磷酸衍生物ZMP直接激活AMPK[7]；A-769662可通过在Thr-172处的AMPKα1变构活化来刺激AMPK，以剂量响应的方式选择性、可逆性地直接激活从多种组织和物种中提取的AMPK[8]。二甲双胍则通过阻断线粒体呼吸链复合体I的电子传递，抑制细胞的氧化磷酸化来间接激活AMPK[1, 9]，其过程是非特异性的。此三种激动剂的作用途径均不相同。

二甲双胍是天然植物紫丁香产品的衍生物[10]，一些其他的天然产物也能够激活AMPK，例如红葡萄中的白藜芦醇、许多水果和蔬菜中存在的槲皮素、雪莲中的虎杖苷、姜黄中的姜黄素、人参中的人参皂苷、黄连中的小檗碱、绿茶中的姜辣素和桑色素，存在于某些海藻中的天然海洋酸红藻氨酸、从苦瓜中分离出来的葫芦酸三萜类化合物和水杨酸盐等[11]。此外，关于AMPK激动剂还包括合成的新型3,5-二甲基吡啶-4(1H)-1支架化合物[12]、2- {2-[4-(三氟甲基)苯基氨基]噻唑-4-基}乙酸等[13]。

已有大量研究[14]将AICAR、二甲双胍等常用的AMPK激动剂应用于调节细胞的成骨分化以促进成骨，AMPK激动剂可作为靶向促成骨药物应用于骨缺损修复。糖尿病可引起体内骨组织异常，具体可表现为骨量减少和骨质疏松等症状[15]。二甲双胍通过激活AMPK和促Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx 2)表达产生直接促成骨作用，并通过改善体内高血糖环境间接促进成骨[14]，既可以降低糖尿病患者骨折的风险，又能促进骨折的愈合。

1.2 AMPK抑制剂

化合物C最初是由Merck从10 K文库筛选并鉴定的AMPK抑制剂，可有效阻断AMPK的代谢作用，已在体内外生化实验中得到证实，并用作AMPK经典抑制剂[16-17]，大量学者[18]将其作为工具药应用于二甲双胍及AMPK作用机制的研究，均得到特异性抑制作用。据报道，化合物C可以减弱不同类型细胞中的AMPK表达[19]，并抑制细胞的成骨分化作用[20-21]。作为AMPK高度非特异性的一般细胞周期抑制剂，腺嘌呤阿拉伯糖苷或Ara-A也在少数研究中用于抑制AMPK活性[18]。

2 AMPK通路在骨代谢中的作用

AMPK亚基在骨组织和细胞中广泛表达，而AMPK组织亚基在骨中表达为主要催化同工型[22]。二甲双胍作为AMPK的经典激活剂，已被证实可促进来自骨髓、胎盘、脐带血、脂肪和肌肉等多种间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的成骨分化，而阻断AMPK通路后，成骨受到抑制[23-26]。同时，Molinuevo等[14]发现当诱导成骨细胞系时，与对照组相比，二甲双胍处理后大鼠的MSCs中AMPK活性和成骨标志物均得到增强。AMPK被抑制后，细胞成骨效果则大大降低[27-28]。有研究[29-31]证明，AMPK激活是通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的表达来增强骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)和内皮型一氧化氮合酶的表达，从而改善成骨细胞的分化和矿化作用。这些都表明，AMPK可在成骨细胞的分化和骨形成中发挥重要的功能。

大量实验显示，敲除小鼠的AMPKα或β亚基会显著降低骨量，通过AMPK调控食物摄取和能量代谢的生长因子和激素也同样调控各种骨细胞中的AMPK活性[32]。Kanazawa等[33]发现，与野生型和AMPK+/-小鼠相比，成骨细胞中缺少AMPK的小鼠(AMPK-/-小鼠)表现为出生后骨骼发育迟缓，8周龄时皮质骨长度和密度显著减少，颅骨发育缺陷。AMPK-/-成骨细胞中成骨相关基因的表达受到显著抑制，而破骨相关因子的表达显著增加。成骨细胞中AMPK的缺失通过增加核因子κ受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)的表达抑制成骨细胞的分化并加剧骨丢失。Shah等[27]的研究发现敲除AMPK亚基的小鼠表现出骨皮质和骨小梁间隔较小。随后Jeyabalan等[34]发现AMPK缺陷小鼠受卵巢切除术引起的负骨平衡影响较小，但在甲状旁腺素间歇给药诱导的骨皮质、骨小梁形成增加时更加显著，作者认为AMPK参与骨重建的激素调节。将AMPK激动剂二甲双胍置于实验性根尖周炎大鼠的根管内，可抑制部分成骨细胞凋亡，减少骨吸收，并抑制诱导型一氧化氮合酶表达和单核细胞募集，达到改善根尖周炎的效果[35]。也有报道[36]表明二甲双胍可以通过促成骨细胞分化来增加患牙周炎大鼠的骨密度和牙槽骨矿化。这些发现都提示AMPK在体内外骨再生中起着不可忽视的作用。

3 AMPK成骨的机制

骨骼主要通过三种细胞类型(成骨细胞、破骨细胞和骨细胞)进行吸收和重建，在正常骨骼的吸收和重建过程之间具有微妙的平衡。AMPK被激活后，一方面可直接抑制破骨细胞的生成[37]；另一方面可刺激成骨细胞中骨保护素(osteoprotegerin，OPG)的生成、减少RANKL的表达而间接抑制破骨细胞的分化[38]。此外，Yokomoto等[22]发现激活AMPK可显著降低小鼠长骨细胞中RANKL的表达，敲除AMPKα1后，RANKL表达显著提高。组织蛋白酶K(Cathepsin K，CTSK)和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)是破骨细胞产生以及骨吸收的关键因素。用二甲双胍处理大鼠成骨细胞后，细胞分泌的上清液可显著抑制破骨细胞的形成及CTSK和TRAP的表达，增加骨量[38]。也有研究[39]报道，高糖环境可促进AMPK磷酸化，抑制活化T细胞1(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1，NFATc1)，从而抑制下游因子脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，SYK)、CTSK和TRAP的表达，还可影响骨吸收和破骨细胞的分化。因此，AMPK可能在骨形成和骨吸收中起到关键作用。

血管生成在器官形成和伤口恢复中起着重要作用，缺血是影响骨愈合的主要危险因素之一。血管在提供氧气的同时充当成骨细胞运输的管道[40]。血管活性肠肽可增加大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，通过激活Wnt/β-catenin信号通路，在体外促进BMSCs成骨和血管生成分化，促进体内骨修复[41]。BMSCs来源的外泌体通过促进成骨和血管生成在大鼠骨折模型的治疗中起着关键作用，这种促进作用可能与激活BMP-2/SMAD1/RUNX2和HIF-1α/VEGF信号通路有关[42]，而AMPK激活可以促进成血管-成骨因子VEGFA、BMP-2的产生[43]。有研究[44]报道在糖尿病患者体内观察到血管内皮祖细胞功能受损，并且伴有AMPK激活减少。促红细胞生成素等药物可以激活AMPK促进小鼠血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，并增加缺血肢体的毛细血管密度[45-46]。以上研究表明，AMPK可以通过调节血管生成促进骨再生。

既往研究表明，自噬与MSCs成骨分化、肿瘤、糖尿病以及免疫失调等疾病密切相关。一方面，AMPK促成骨的机制可能与其正调控细胞的自噬有关。有研究[47]表明，AMPK可通过AMPK/mTOR/UKL通路调控细胞自噬。线粒体磷酸烯醇丙酮酸羧增多能够引起MSCs中AMPK/UNC-51活化并促进细胞自噬，最终促进成骨分化[48]。芒果苷可通过激活AMPK通路引起软骨细胞的自噬，从而促进软骨内成骨，改善骨修复效果[49]。神经肽P物质可经由AMPK和mTOR途径诱导大鼠来源的骨髓间充质干细胞自噬，减少活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)产生，促进成骨细胞分化[50]。另一方面，抑制AMPK信号通路后，细胞的自噬下调，MSCs的成骨分化也受到抑制[48]。这些研究表明AMPK调节骨代谢的作用可能与其影响自噬密切相关。

尽管有大量研究报道激活AMPK可正调控体内外的骨形成，但亦有部分研究报道得到相反的结果。Kasai等[51]的研究认为，二甲双胍激活AMPK后，MC3T3E和大鼠来源原代成骨细胞的成骨分化受到明显抑制。Jeyabalan 等[40]报道二甲双胍对体内成骨作用无影响。Baston等[52]发现，AMPK的激活剂二甲双胍对非糖尿病大鼠钛植入物的骨愈合产生负面影响，其主要机制可能是降低植入物周围骨、植入物接触与骨面积的百分比以及增加RANKL的表达。由此可见，AMPK在骨代谢的具体作用仍存在争议。

4 展望

作为“代谢调节器”，AMPK对机体多个生理过程具有调节作用，近年来其在调节骨代谢中的重要作用也逐渐受到重视。AMPK有望作为治疗骨质疏松症和骨缺损的一个潜在靶点，但是尚无体内研究支持AMPK的直接激活可以促进成骨。另外目前研究中使用的AMPK激动剂对骨组织并非具有特异性，且AMPK对细胞的广泛作用使其难以体内应用。考虑到AMPK在骨组织表达的亚型与其他组织不同，开发靶向骨组织的特异性AMPK激动剂可克服上述困难。对于AMPK作用于骨代谢的具体机制、特异性激活药物的开发仍有待研究，需要进一步深入探索。