不同来源外泌体在原发性骨质疏松中的研究进展

唐彬彬 袁一峰 王申 余阳 陈天鹏 刘康 吴连国 史晓林*

1.浙江中医药大学附属第二医院，浙江 杭州 310005

2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053

原发性骨质疏松(primary osteoporosis，POP)包括绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松。雌激素缺乏是绝经后骨质疏松的诱因，而老年性骨质疏松则与年龄相关。从骨细胞代谢来看，POP是由于骨重建失衡，导致骨组织微结构改变、骨量降低，以致骨脆性增加，易发生骨折的全身性骨病。2018年，国家卫生健康委发布称骨质疏松症(osteoporosis，OP)已经成为我国50岁以上人群的重要健康问题，中老年女性骨质疏松问题尤为严重[1]。50岁以上人群POP患病率为19.2%，其中女性为32.1%；65岁以上人群POP患病率达到32.0%，其中男性为10.7%，女性为51.6%[1]。因此，开展治疗和预防骨质疏松症的相关研究是十分必要的。

POP是由多种基因-环境因素等微小作用积累的共同结果[2]。当前，在细胞-因子层面研究如何防治骨质疏松症的报道较多，尤其是对细胞来源外泌体(exosomes)的研究。外泌体是一类由脂质双分子层构成，大小30～140 nm的细胞外囊泡，包含多种蛋白质、RNA、DNA和可以在细胞之间转移的生物活性脂质[3-4]。外泌体不仅可被不同类型的健康或患病细胞释放，也可由体外培养的细胞分泌，包括各种干细胞、骨细胞、内皮细胞、免疫细胞、肿瘤细胞等，也存在各种体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。研究表明，外泌体可参与各种疾病的发展和进程。在骨生物中的作用体现在骨组织损伤退变、骨质疏松、成骨不全及骨折不愈合等[5-6]。骨质疏松方面，外泌体的作用突出，已作为治疗OP的新方法，具有极大的治疗潜力[7-8]。近年来研究发现，不同细胞来源外泌体可调节骨代谢[9-11]，参与骨重建改善POP[12-13]。而外泌体的功能的机制与microRNA(miRNA)[10，14-16]、long noncoding RNAs(lncRNA)[17-18]有关。本文将就不同来源外泌体在POP的研究进展进行综述。

1 间充质干细胞来源外泌体

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)从成人组织中分离，具有广泛的增殖和分化成各种细胞谱系的能力[19]。近年来，在组织修复中，MSC的治疗机制发生了从基于细胞分化和置换转变为基于细胞分泌和旁分泌信号[20]。在广泛的营养因子中，MSC来源外泌体在包括骨缺损和骨质疏松在内的多种损伤或疾病适应证中具有治疗效果[19，21-22]。一项包含23项动物研究的系统回顾发现MSC来源外泌体促进新骨形成，改善骨形态，抑制骨衰老，并对成骨细胞存活、增殖和迁移，形成产生了积极影响[20]。关于MSC来源外泌体的促成骨机制认为与外泌体差异表达的miRNA有关。miRNA参与并丰富了成骨分化的调控途径，比如“Wnt信号传导途径”和“内吞作用(endocytosis)”[23]。

1.1 骨髓间充质干细胞来源外泌体

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是指从人体或动物骨髓中分离出来的一类干细胞，具有促进骨愈合、骨细胞生长、骨形成的重要作用。

BMSCs来源外泌体可抑制细胞凋亡信号通路，促进成骨细胞增殖，改善POP[24-28]。研究发现外泌体干预显著降低了成骨细胞中凋亡相关的促凋亡蛋白细胞色素C和凋亡蛋白酶caspase3的表达，增强了细胞活力，并减弱了细胞凋亡[26]。采用BMSCs外泌体抑制Bax/Bcl-2/Caspase凋亡信号通路，通过干预卵巢切除(ovariectomized，OVX)小鼠后，发现血清骨钙素、骨矿物质密度和体积均显著高于对照组[27]。Zhao等[25]与Xie等[24]报道基于MAPK通路，BMSCs来源外泌体可以促进人成骨细胞系-hFOB1.19细胞增殖和分化，并下调相关凋亡基因。机制研究揭示了BMSCs外泌体中的miRNA作用较大。MiR-150-3p具有促进POP中成骨细胞的增殖和分化[29]。MiR-29a可以被转运到人脐静脉内皮细胞调节血管生成及成骨，成为治疗POP的潜在靶标[30]。BMSCs外泌体中lncRNA-MALAT1(转移相关的肺腺癌转录因子1)可结合miR-34c以促进SATB2的表达，增强OVX小鼠成骨细胞活性，SATB2具有促进成骨分化的作用[31]。然而，miR-21靶向作用SMAD7抑制了相关成骨因子的表达，加重POP[32-33]。体内实验发现老龄大鼠BMSCs中miR-31a-5p显著增加，抑制成骨细胞分化[34]。上述研究说明BMSCs源性外泌体在原发性骨质疏松症具有研究意义。

中医学认为原发性骨质疏松具有肾虚、骨痿、髓减的病机特点，“肾主骨生髓”是防治POP的核心理论，符合BMSCs源性外泌体的作用机制，这也为中医学治疗骨质疏松症提供新思路[35]。

1.2 人脐带间充质干细胞来源外泌体

研究表明，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)来源外泌体具有刺激骨形成，抑制骨吸收的双向调控作用，能通过miRNA介导抑制BMSCs凋亡，减少骨髓内脂肪累积，实现减少骨丢失和维持骨强度的作用[36-38]。研究发现HUCMSCs来源外泌体内富含成骨蛋白CLEC11 A (C-type lectin domain family 11, member A)，CLEC11 A可以影响破骨细胞形成，调节骨代谢[37]。MiR-1263可结合Mob1-3'UTR，可激活Hippo通路[39]，最终抑制BMSCs凋亡，预防OP[38]。MiR-3960可促进BMSCs的成骨作用，减少年龄相关OP的骨流失[36]。

1.3 其他干细胞来源外泌体

2017年，Zhu等[40]报道小鼠脂肪干细胞来源外泌体减少骨细胞的凋亡。近两年，报道人尿液干细胞和人乳牙干细胞具有相似的作用。Yang等[41]研究发现人尿来源干细胞(urine-derived stem cells，USCs)源性外泌体后可以缓解骨质疏松小鼠骨丢失，保持骨强度。外泌体内富含CTHRC1(collagen triple-helix repeat containing 1)及骨保护素，是促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞分化所必需的。由于USCs来源外泌体具有可无创性采集，不受供体年龄、性别、健康状况影响的优点，有望成为治疗POP的新制剂。Sonoda等[42]研究发现人脱落乳牙(human exfoliated deciduous teeth，SHED)释放细胞外外泌体，靶向干预BMSC的端粒酶活性，并将处理后BMSC移植入OVX小鼠背部皮肤，可促进骨质疏松小鼠的成骨能力。上述研究均提示人体干细胞来源外泌体具有促进成骨分化的作用，对治疗POP表现出新的机制和作用。

2 破骨细胞来源外泌体

破骨细胞(osteoclast，OC)来源外泌体具有促进OC分化，调控破骨和成骨细胞交流，调节骨代谢的作用[43-44]。研究发现OC来源的外泌体可通过传递 miR-214-3p 至成骨细胞中抑制成骨细胞分化，miR-214-3p 高表达的转基因小鼠骨形成受到抑制[45]。Zhu等[46]报道采用磁性羟基磷灰石(MHA)支架可以降低OB摄取外泌体的效率，从而促进成骨细胞增殖。近几年相关研究发现微重力环境诱导的骨质疏松模型研OC外泌体内的miRNA表达异常，可通过Wnt/β-catenin信号通路，抑制成骨分化[47-48]。但对POP的研究报道较少，今后可作为一个新的研究方向。

3 成骨细胞来源外泌体

成骨细胞(osteoblasts，OB)来源外泌体也具有抗POP的作用。研究报道来自中晚期阶段OB的外泌体可显著促进BMSCs的成骨分化，并改善OVX小鼠的骨质疏松症，可运用于骨组织工程研究[49]。Tang等[50]报道成骨细胞来源外泌体miR-433-3p可抑制90%的DKK1蛋白表达，明显降低DKK1对Wnt/β-catenin的抑制作用，来促进OVX小鼠成骨细胞分化而发挥作用。然而，报道在OVX小鼠体内注射OB和OB来源外泌体后发现，注射OB具有更强的成骨能力[51]。因此，目前关于OB来源外泌体的抗POP作用仍在一定的争议，需要进一步研究发现。

4 肌细胞来源外泌体

近年来，肌肉骨骼被认为是内分泌器官影响各自的功能，用肌骨“crosstalk”形容它们的关联。研究发现这种关联是通过肌动蛋白和骨衍生因子实现的[52]，可作为用于骨质疏松症和肌少症的新疗法。Takafuji等[53]对肌骨“crosstalk”的内在机制进行探究，发现C2C12成肌细胞可分泌外泌体抑制破骨细胞分化，接着通过miRNA测序发现C2C12成肌细胞miR-196a-5p表达较高，具有抑制破骨细胞正常功能，增强成骨细胞功能的作用[54]。但是，C2C12成肌细胞外泌体miR-34a则增加了BMSCs的凋亡[55]。基于骨骼肌来源外泌体内在机制，也符合中医认为老年性骨质疏松是由于脾肾失司致肌肉骨骼失调失养引起的[56]。上述研究表明成肌细胞外泌体是进行肌骨相互作用的关键因素，是治疗POP的潜在制剂。

5 血管内皮细胞来源外泌体

据报道，血管内皮细胞(endothelial cell，EC)在骨稳态中具有一定的作用，但EC外泌体在骨质疏松中作用报道较少。查阅相关文献，仅Song等[57]报道EC来源外泌体抑制破骨细胞的活性，并在OVX小鼠模型中抑制骨质疏松，但EC来源外泌体可被骨髓来源的巨噬细胞(BMM)内化减低作用。通过对EC外泌体miRNA测序，发现外泌体内富含miR-155，远超于BMM内的miR-155，进而抑制破骨细胞活性。该研究反映了EC外泌体具有抗骨质疏松治疗潜力。

6 血清来源外泌体

血清来源外泌体(serum-derived exosomes，SDEs)对评估和诊断OP具有一定的价值。外泌体miRNA与骨质疏松症的发生发展有着密切的关系。通过对患者血清外泌体miRNA检测，可以及时预测骨质疏松症的发生，进而减少脆性骨折的风险，对骨质疏松症的早期诊断有着重要意义[58-59]。初步研究发现OVX小鼠血清外泌体可以促进成骨细胞增殖和血管内皮细胞生长因子高表达[60]。Huo等[59]开展临床研究对骨量正常、骨量减少和骨质疏松三类研究对象进行血清外泌体的定量分析，发现17种蛋白在骨量减少和骨质疏松均下调。Xie等[61]对骨质疏松症或骨质减少的老年患者和正常志愿者血清中的外泌体进行了蛋白质组学定量分析，发现骨质疏松症患者的SDE中的蛋白质变化不仅抑制成骨细胞的机械感觉和激活，还引发破骨细胞的分化和吸收。相反，骨质减少患者的SDE的主要变化既促进破骨细胞的活化，又促进新骨质的形成，导致骨重塑的代偿性升高。正常人SDE可能通过促进骨细胞粘附并抑制衰老相关的氧化应激而对骨骼健康起到保护作用。Ramirez等[62]对20例骨质疏松患者和20例健康妇女的血清外泌体miRNA进行研究，采用实时定量RT-PCR技术对754个miRNAs进行分析，发现miR-140-3p和miR-23b-3p作为绝经后墨西哥混血儿妇女骨质疏松和骨质疏松性骨折的潜在生物标志物。上述研究体现了外泌体及miRNA具有治疗骨质疏松的作用，说明人血清外泌体开展临床研究具有可操作性，对外泌体及miRNA用于临床治疗具有推动作用。

7 牛初乳来源外泌体

牛奶来源的外泌体能在细胞间的通讯中起着重要的作用，可治疗肥胖、2型糖尿病、骨质疏松症、癌症等疾病[63]。对激素诱导骨质疏松小鼠口服两个月乳源性外泌体，发现实验组小鼠的骨矿物质密度显著提高[64]。牛初乳中分离出的外泌体可能是预防骨质疏松症，改善骨重塑和抑制骨吸收的潜在候选者，对治疗老年性骨质疏松症提供了重要的策略。

8 外泌体研究展望

原发性骨质疏松是最常见的骨代谢疾病，发病率最高，并发症最多。通过对不同细胞来源外泌体的相关研究进行简单综述，发现细胞外泌体治疗POP具有巨大的潜力。特别是间充质干细胞来源外泌体具有重要的促成骨细胞增殖，抑制细胞凋亡的作用，具有研究意义。成骨细胞及破骨细胞来源外泌体能为细胞相互作用构建起桥梁，调节骨代谢，对体外研究具有较大意义。肌细胞外泌体作用的研究，提示肌骨交互可能是治疗POP的新靶标。人血清来源外泌体测定对骨质疏松症的早期诊断及预防具有重要意义，可用于临床研究，同时对外泌体及miRNA用于临床治疗具有推动作用。与此同时，应重视相关食物来源外泌体的抗骨质疏松作用，例如牛初乳来源的外泌体。

综上所述，本文主要阐述了不同来源外泌体在防治原发性骨质疏松方面的应用。然而，不同外泌体介导信号通路中具体分子机制未十分明确，同类外泌体存在不同作用miRNA的情况。未来临床应用也面临着许多尚未解决的问题。但随着研究的深入，不同外泌体的作用也将逐渐被发掘，未来的应用前景将十分广阔。