石斛提取物与糖尿病视网膜病变相关研究进展

俞越，李春霞，史春

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见的微血管并发症，是导致全球工作年龄人群视力障碍和失明的主要原因之一，大约1/3的糖尿病患者发生视力损害。目前，用于治疗DR 的主要有效方法包括视网膜激光光凝术、玻璃体切割术、皮质类固醇或抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）治疗，这些方法虽有效果，但不能完全消除疾病的进展或逆转视网膜损伤[1-4]。中药是用于预防、治疗、诊断疾病并具有康复与保健作用的物质。其中石斛是我国的名贵药材，始载于 《神农本草经》[5]：“主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳，羸瘦，强阴，久服厚肠胃，轻身延年”。在2015 年版《中华人民共和国药典》[6]中收录了4 种石斛，分别为铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛，其具有多种化学成分。近年来，国内外研究[6-9]发现，降血糖、抗血管生成、抗炎、抗氧化应激等是石斛主要的药理活性。本文就石斛总提取物及石斛酚、石斛多糖、毛兰素、石斛碱对DR 的作用及机制进行论述。

1 石斛的化学成分及主要特征

石斛的主要化学成分为联苄类、多糖类、菲类、生物碱类和香豆素类等[9]。多糖类是石斛的主要成分之一，抗氧化及降血糖是石斛多糖的主要作用。廖滢等[10]发现，酸性多糖抗氧化活性与糖醛酸官能团含量正相关，与硫酸糖含量负相关。

石斛碱是金钗石斛的特征性成分，具有显著的生物活性，常作为金钗石斛定性定量的重要指标。《中华人民共和国药典》[6]规定金钗石斛的石斛碱含量不得低于0.4%。汪代芳等[11]从金钗石斛中分离出11 种化合物，其中包括2 个石斛素型生物碱：石斛碱、石斛醚碱；5 个有机胺类生物碱：N-反式桂皮酸酰对羟基苯乙胺，N-反式阿魏酸酰对羟基苯乙胺，N-顺式阿魏酸酰对羟基苯乙胺，N-反式香豆酰酪胺，N-顺式香豆酰酪胺。

联苄类与菲类具有良好的体外抗血管生成及清除自由基的作用。目前已从7 种石斛中提取到9 种具有菲核的化合物，从5 种石斛中提取到8 种具有9、10-双氢菲母核的化合物，从4 种石斛中提取到5 种具有菲醌母核的化合物；从14 种石斛中提取出15 种具有联苄类母核的化合物。其中石斛酚、毛兰素、杓唇石斛素、鼓槌联苄及鼓槌石斛素均属于石斛中的联苄类化合物，石斛酚的含量为0.0004%～0.391%；杓唇石斛素的含量为0.001%～0.244%；毛兰素的含量为0.001%～1.68%；鼓槌联苄的含量为0.001%～0.044%；鼓槌石斛素的含量为0.001%～0.027%[12]。

香豆素类具有良好的扩张血管、抗凝血等功能，其主要包括香豆素（coumarin）、东莨菪内酯（scopoletin）、滨蒿内酯（scoparone）和泽兰内酯（ayapin）。通过鉴定发现香豆素的含量为0.0050%～0.0623%；东莨菪内酯的含量为0.0038%～0.0164%；滨蒿内酯为0.0087%～0.34%；泽兰内酯为0.005%～0.197%[12]。

2 石斛提取物与DR 的相关研究

2.1 石斛总提取物与DR

石斛自古以来就是治疗消渴的专药。目前研究发现，石斛总提取物在DR 的动物模型中有治疗作用。石斛总提取物可以抑制人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）上VEGF 诱导的毛细血管生成，还可以通过上调胰岛素的分泌、促进肝糖原的合成、降低胰高血糖素分泌的方式起到抗糖尿病的作用[13]。宓文佳等[14]研究了石斛根提取物对糖尿病鼠的降糖作用。运用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）造模的糖尿病大鼠在使用铁皮石斛根提取物后，血糖、糖化血红蛋白、血清胰岛素等检测指标均下降，表明铁皮石斛根提取物可以降低2 型糖尿病模型小鼠的空腹血糖，并能有效改善小鼠的毛色、体温、活动量，生活质量和口服糖耐量。高玮等[15]研究了鼓槌石斛乙醇提取物对糖尿病大鼠视网膜凋亡相关因子表达的影响。病理结果显示，鼓槌石斛乙醇提取物干预后的糖尿病大鼠视网膜内、外核层界限较糖尿病组清晰，神经节细胞层肿胀减轻；免疫组化结果显示，药物干预组的大鼠只在视网膜神经节细胞层、色素上皮层存在Caspase-3 阳性表达，且呈剂量依赖性递减。这些结果提示，鼓槌石斛乙醇提取物可能通过抑制细胞凋亡对糖尿病大鼠的视网膜组织病变起到保护作用。Lee 等[16]研究了鼓槌石斛乙醇提取物对DR 的效果及其机制。视网膜荧光染色结果显示，鼓槌石斛乙醇提取物可降低STZ 诱导的糖尿病大鼠视网膜血管的异常增殖；q-PCR 结果表明，它可以降低VEGF、VEGFR-2 mRNA 的表达以及血清中VEGF 的水平；糖尿病组在治疗后，视网膜MMP2/9、血清MMP2/9、血小板衍生生长因子A/B、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、p65 磷酸化和ICAM-1 的水平被抑制。这些发现表明，鼓槌石斛乙醇提取物对炎性因子和糖尿病大鼠视网膜内紧密连接蛋白有抑制作用。

2.2 石斛酚与DR

石斛酚是从石斛中提取出的一种联苄类化合物，常被作为衡量石斛药材质量的质控指标[17]。醛糖还原酶（aldose reductase，AR）是DR 发病机制中多元醇通路的关键限速酶，AR 的增加会促使1 型糖尿病患者对视网膜病变的易感性增加[18]。魏小勇等[19]研究发现，石斛酚对AR 的活性有抑制作用。张梅等[8]研究了石斛酚对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs，ACBRI181）中AR 通路和氧化应激的作用机制。荧光探针DCFH-DA 活性氧检测结果显示，各石斛酚组的HRMECs 中活性氧（reactive oxygen species，ROS）表达均低于高糖组；qRT-PCR 结果显示，石斛酚组的缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）/VEGF 表达低于高糖组；Western blotting 结果显示，石斛酚各组核转录因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白表达低于高糖组。这些结果提示，石斛酚能抑制HRMECs 中AR 通路和氧化应激反应的表达，并能抑制VEGF 的表达。

在DR 早期血-视网膜屏障通透性增强，因此，保护血管内皮细胞对于其治疗具有重要意义。徐万里等[20]研究了石斛酚对高糖损伤的人脐静脉的永生化内皮细胞（EA.hy926）的保护作用及其机制。在细胞抗氧化实验中发现，在高糖+2.5 μM 石斛酚组中的细胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）低于高糖组，且脂质过氧化物丙二醛含量较高糖组增加；细胞活性检测显示，使用2.5 μM 的石斛酚干预后细胞凋亡率低于高糖组。这些结果提示，石斛酚能抑制半胱天冬酶-3 活性，降低细胞凋亡率，提高细胞活力。此外，石斛酚还可以降低高糖对内皮细胞的损伤程度，有助于维护血管的结构和功能完整。

2.3 石斛多糖与DR

降血糖是石斛多糖的主要生物学作用之一，石斛中含有较多的多糖类成分，粘稠高，总多糖含量最高在30%～45%之间[21-22]。Müller 细胞是一种特化的神经胶质细胞，具有维持视网膜正常结构的功能，在DR 进展中可能起着重要作用。李雅嘉等[23]研究了铁皮石斛多糖保护糖尿病引起的视网膜损伤的作用机制。MTT 实验结果显示，铁皮石斛多糖组的Müller 细胞活力高于高糖组，且呈浓度依赖性增加；细胞凋亡实验显示，石斛多糖组中的Müller 细胞凋亡低于高糖组，且呈浓度依赖性减少。上述结果提示，铁皮石斛多糖可能通过提高Müller 细胞活性，减少Müller 细胞的凋亡，达到保护Müller细胞的作用。

炎症是DR 的重要发病机制之一，在DR 早期发挥了重要作用。李静文等[24]采用STZ 诱导的SD 大鼠糖尿病模型，探讨石斛多糖在早期DR 中的抗炎作用和机制。研究发现，石斛多糖组中IL-6，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），VEGF 蛋白表达较糖尿病组下降，认为抗炎作用机制可能与其抑制NF-κB 表达有关。这些结果提示，石斛多糖可降低糖尿病大鼠视网膜中炎性因子及VEGF 的表达。

张贝贝等[25]研究了石斛多糖对糖尿病引起的血管内皮细胞损害的作用机制。首先运用qRT-PCR 检测发现，铁皮石斛组中Bax mRNA 的表达低于高糖组，且随着铁皮石斛活性成分浓度的增加，抑制作用增强；随后运用MTT 法检测HUVEC细胞活性发现，铁皮石斛多糖组的细胞生长优于高糖组，细胞凋亡低于多糖组。通过上述研究发现，铁皮石斛多糖可能从基因水平抑制高糖诱导的HUVEC 中Bax mRNA 表达，增强Bcl-2mRNA 表达，抑制血管内皮细胞凋亡，从而达到防治DR 的目的。

2.4 毛兰素与DR

毛兰素是普遍存在于石斛中的一种低分子量的天然产物，其抗氧化和抗血管增生作用是其公认的重要药理作用。鼓槌石斛中分离得到的5 种化合物，分别鉴定为毛兰素、β-谷甾醇、鼓槌菲、毛兰菲和鼓槌联苄，其中毛兰素含量最高[26]。同时我国药典[7]中已确定了毛兰素作为鉴别鼓槌石斛的主要成分。DR 分为2 个阶段：非增殖性糖尿病视网膜病变（non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）和增殖性糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR）。其中PDR的标志性特征便在于视网膜或视盘表面上异常增殖的新生血管。VEGF 是一种有效的内皮细胞有丝分裂原。其作用通过刺激增殖，迁移和管腔的形成，促进新生血管的生成[27-28]。高玮[29]研究了鼓槌石斛的活性成分毛兰素对高糖诱导的恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞（RF/6A）的作用机制。结果显示，毛兰素组中PERK-eIF2α-CHOP 信号通路的表达低于高糖组；在使用毛兰素干预后RF/6A 细胞中炎性因子IL-1、IL-6 及TNF-α 水平的表达较高糖组降低，且VEGF 信号通路的基因表达低于高糖组。Yu 等[30]探讨了毛兰素对视网膜新生血管形成的抑制机制及其对DR 改善的作用。在体外实验研究中发现，毛兰素可以抑制高糖诱导的RF/6A 细胞中的血管形成，且效果优于贝伐单抗，此外，毛兰素可以抑制RF/6A 细胞中的高糖诱导的HIF-1α 介导的VEGF 表达；在体内实验中还发现，毛兰素可以消除STZ 诱导的高血糖小鼠视网膜中的新生血管。上述实验结果表明，毛兰素通过阻断视网膜内皮细胞和小神经胶质细胞中ERK1/2 介导的HIF-1α 活化来消除高糖诱导的VEGF 表达，并进一步抑制VEGF 诱导的VEGFR2 及其下游信号的激活，从而抑制视网膜新血管生成。Zhang T 等[31]研究鼓槌石斛提取物毛兰素对于DR 进展中的保护作用发现，毛兰素可以减轻血-视网膜屏障的分解，减少小胶质细胞活化，ERK1/2 磷酸化，NF-κB 转录激活和TNF-α表达升高。上述结果提示，毛兰素可能通过ERK1/2-NF-κB信号通路抑制高血糖介导的小神经胶质细胞的活化减少视网膜炎症来减轻DR。

2.5 石斛碱与DR

生物碱类成分是最早从石斛属植物中分离得到的化合物，也是最早受到关注和研究的化学成分。铃木秀干等首次从金钗石斛中获得生物碱，命名为石斛碱[21]。通过现代药理学研究[6]发现，降血糖是金钗石斛的主要药理作用之一，其小分子的化学成分以石斛碱等生物碱为主，但尚未有研究证明石斛碱与DR 之间的相关性。

3 小结

综上所述，石斛提取物对DR 的发病机制具有抑制作用，针对石斛中具体组分的研究主要从石斛酚、石斛多糖、毛兰素等的抗VEGF、抗炎、抗氧化等通路展开。石斛生物碱作为金钗石斛中最重要的成分之一，对于其治疗DR 的作用机制尚不可知。此外，胶质、神经和微血管功能障碍也是引发DR的重要机制[32]，石斛提取物对于这些机制的效应也值得进一步关注。