抑制或基因敲除HDACs在不同视神经损伤模型中神经保护作用的研究进展

于坷鑫，孙河

青光眼是视神经损伤疾病的典型代表之一，其主要病理特征是进行性、特异性的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）丢失及由此引起的视野缺损。病理性眼压升高对视神经的机械性压迫学说，以及视网膜和视神经血流灌注异常的缺血学说，在青光眼发病机理中占据重要地位[1]。RGCs调亡则是青光眼长期渐进式视神经损害的病理基础，探索RGCs 的凋亡机制，特异性阻断RGCs 的损伤过程，成为视神经保护的关注要点。越来越多的证据[2-5]表明，组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDACs）的活性是神经元死亡的重要原因之一，与亨廷顿氏病、中风和缺血性损伤、脊髓-小脑共济失调7 型的动物模型以及可卡因导致的记忆丧失有关。近年来，HDACs 已被确定为是神经退行性病变潜在的治疗靶点，HDACs 抑制疗法将成为青光眼视神经损伤的未来治疗策略。本文将具体阐述抑制或基因敲除HDACs 在不同视神经损伤模型中神经保护作用的研究进展。

1 组蛋白乙酰化与HDACs

在真核细胞中，DNA 被高度保守的组蛋白H2A、H2B、H3和H4 包裹成核小体，形成染色质的基本单位。染色质重塑在基因表达调控中起着关键作用。表观遗传修饰可以在不改变DNA 序列的情况下调控可遗传或可逆的基因表达，也可以改变染色质结构及其可塑性。DNA 甲基化和组蛋白翻译后修饰（histone post-translational modification，PTM）是基因表达表观遗传调控的两个主要机制。PTM 在化学上具有多样化，包括乙酰化、磷酸化、泛素化、甲基化、ADP 核糖基化和生物素化[6]。其中，组蛋白乙酰化是影响基因转录的主要修饰，受组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HATs）和HDACs 二者的动态调控。HATs 乙酰化组蛋白的赖氨酸，导致染色质结构松散，也促进了基因的表达。相反，HDACs 从高度乙酰化的组蛋白中去除乙酰基，使染色质结构紧密，并抑制一般基因转录。除了影响基因表达外，HDACs 还能通过去乙酰化非组蛋白靶点底物而发挥作用，在细胞和系统水平上改变信号，并导致细胞分化和细胞类型的特异性效应。

在神经病理条件下，HATs/HDACs 平衡的紊乱会导致染色质重塑和基因转录异常，进而对细胞的存活产生不利影响。事实[7]证明，神经变性状态所涉及到的主要的细胞死亡和功能缺失，皆与组蛋白乙酰化紊乱有关。在高眼压、视神经损伤以及缺血缺氧等多种致病因素导致的神经病理情况下，HATs 常常被降解，活性丧失，相比之下，HDACs 活性明显增强，组蛋白乙酰化动态平衡活性被破坏，去乙酰化活动相对过度；伴随此过程，HATs 形成的辅抑制因子和HDACs 形成的辅激活因子（均为一种基因转录调控复合物），进一步加剧去乙酰化活动，促使异染色质生成以及特异基因的沉默，从而导致神经细胞的生理功能紊乱[8]。

2 HDACs 分类

已知哺乳动物细胞中有18 种HDACs，基于酵母HDACs的同源性划分为4 类。Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类HDACs 是锌依赖性酶，而Ⅲ类HDACs 是NAD+依赖性酶。由HDAC1，HDAC2，HDAC3 和HDAC8组成的Ⅰ类HDACs 在所有组织的细胞核中普遍表达。HDAC1 和HDAC2 主要是存在于核，而HDAC3和HDAC8 可以进出细胞核[9]，许多底物包括肿瘤抑制因子、类固醇受体及转录因子已被确认为是Ⅰ类HDACs 去乙酰化的底物。Ⅱ类HDACs 与组织特异性功能相关，可使许多非组蛋白底物去乙酰化。Ⅱ类HDACs 又分为2 类：Ⅱa 类由HDAC4，HDAC5，HDAC7 和HDAC9组成；Ⅱb 类由HDAC6和HDAC10组成。Ⅱa 类HDACs 显示核和细胞质定位，以信号依赖的方式在核质间穿梭[9-10]。Ⅱb 类HDACs 主要位于细胞质中，主要作为信号转导和运动的调节剂起作用，可使皮质激素，热休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）和微管蛋白去乙酰化[11]。HDAC11 是Ⅳ类HDACs 的唯一成员，与Ⅰ类和Ⅱ类HDACs 同源。对HDAC11 知之甚少，但已在肾脏、大脑、睾丸、心脏和骨骼肌中发现有表达[12]，HDAC11 可通过抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）调节少突胶质细胞的发育和白细胞介素-10 的表达[13]。Ⅲ类HDACs，也称为Sirtuins，由SIRT 1-7组成。Sirtuins 在人体组织中广泛表达，调节多种生物学功能，如氧化应激、DNA 修复、代谢和衰老[14]。

3 HDACs 抑制剂

HDAC 抑制剂（Histone deacetylase inhibitor，HDACi）是一类天然的和合成的化合物，在临床和实验研究中具有不同的靶向特异性和活性[15]。HDACi 基于其结构大致分为4 类：异羟肟酸、环肽、苯甲酰胺和短链脂肪酸。美国FDA 批准的抗癌HDACi 中的3 种是异羟肟酸，包括伏立诺他（vorinostat，SAHA），贝利司他（belinostat，PXD101）和帕比司他（panobinostat，LBH589），据报道它们是影响Ⅰ，Ⅱ和Ⅳ类HDACs 的非特异性抑制剂。然而，进一步关于SAHA 的测试[16]表明，它只能在合理浓度下抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3 和HDAC6。其中曲古霉素A（trichostatin a，TSA）是第1 种被证实可广谱抑制HDACs 的天然异羟肟酸抑制剂[17]。第4 种FDA 批准的HDACi 是环肽类的罗米地辛（romidepsin，FK228），据报道对Ⅰ类HDACs 有特异性。此外，LMK-235 原本被认为是Ⅱa 类（HDAC4，HDAC5）选择性抑制剂，但进一步研究[18-19]揭示其有类似SAHA 的抑制特性，因此重新评估表明，LMK-235对Ⅰ类和Ⅱb 类也具有选择性抑制作用。基于苯甲酰胺的HDACi 是第一种选择性靶向Ⅰ类HDACs 抑制剂，例如恩替诺 特 (entinostat，MS-275）可完全抑制HDAC1，HDAC2 和HDAC3。短链脂肪酸类抑制剂丙戊酸(valproic acid，VPA)在高浓度下对于Ⅰ类HDACs 有适度选择性抑制作用。近期报道了一种新的HDACi 家族，酰肼类[20-21]。酰肼类的HDACi 是对HDAC1，HDAC2 和HDAC3 有效的选择性抑制剂，且低浓度下就能发挥抑制作用。

4 抑制或基因敲除HDACs 与视神经保护

4.1 视神经挤压术损伤模型

病理性眼压升高引起视神经头周围的压力增加[22-23]，RGCs轴突在此处进入视神经时会被压迫造成局部损伤[24]。在大多数视神经病变如青光眼的预测病理生理学中，认为轴源性神经变性先于体源性神经变性。视神经挤压（optic nerve crush，ONC）通过诱导部分RGCs 轴突损伤来模拟这种分子事件，是一种广泛认可的急性RGCs 损伤模型，已被用于研究RGCs死亡的内在和外在凋亡机制[25-26]。孙颂美等[27]评估了玻璃体内注射组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA 负载脂质体（TSA 掺入聚乙二醇化脂质体中）在ONC 小鼠模型中的神经保护作用，发现注射后脂质体到达了视网膜内侧，能显着降低反应性胶质增多症和RGCs 凋亡，并增加了RGCs 的存活率。Schmitt 等[28]对C57BL/6 小鼠行ONC 后立即玻璃体腔内注射RGFP966 来选择性抑制HDAC3，分别于5、7、14 d 分析视网膜核萎缩和细胞丢失的程度，发现单次注射会立即引起对核萎缩的保护作用，类似于HDAC3 条件性敲除，且RGFP966 低浓度使用时，可防止细胞凋亡相关的组蛋白去乙酰化，减轻急性视神经损伤后RGCs 的丢失，但在RGFP966 浓度增高后对阻止RGCs 长期丢失的作用也随之减弱。Schmitt 和Pelzel 等[29]通过2 型腺病毒转染小鼠的RGCs，实现对RGCs 中HDAC3 的特异性敲除，之后建立ONC 模型，实验证明RGCs 中HDAC3的敲除可显著改善ONC 诱导的核萎缩的特征，减少RGCs 的死亡，但HDAC3 的敲除并没有影响RGCs 特异性基因沉默的发生。Chindasub 等[30]使用HDAC1/3 选择性抑制剂MS-275对小鼠皮下注射3 次/周，从ONC 前1 周开始，持续6 周。经视网膜荧光神经元平均存活率和病理组织学的统计分析结果证实，MS-275 治疗可预防视神经损伤后RGCs 分化功能的丧失，促进RGCs 存活。Zhang 等[31]在ONC 前1 d 对大鼠皮下注射VPA 和丁酸钠（sodium butyrate，SB；一种广谱HDACi），14 d 后处死。结果显示，VPA 和SB 改善了视网膜电图a 波和b波振幅的降低水平；减弱了RGCs 中胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的激活，并伴有视网膜苏氨酸激酶（threonine kinase，AKT）和细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）磷酸化的上调，认为VPA 可能通过激活BDNF-TRKB 信号通路和抑制HDACs 来阻碍RGCs 凋亡。Pelzel 等[26]先前的研究发现用TSA 抑制视网膜中HDACs 的活性能够维持ONC 后RGCs 特异性基因的表达，特别是HDAC3 可能在凋亡基因沉默中具有重要意义；且TSA 能抑制RGCs 的凋亡。Biermann 等[32]对大鼠左眼行ONC 后，皮下连续注射VPA 或Ringer 溶液。ONC 后5d 和8d，与Ringer 溶液（62%和37%RGCs 存活）相比，皮下VPA 处理后93%和58%RGCs 存活。证明VPA 可介导ONC 后RGCs 的神经保护作用。

4.2 兴奋性毒性诱导损伤模型

兴奋性毒性是一种病理现象，视神经损伤后，损伤的RGCs 和邻近细胞释放谷氨酸，通过与谷氨酸受体结合，促进细胞外Ca2+内流导致神经元死亡[33]。N-甲基-天冬氨酸（Nmethyl-D-aspartate，NMDA）受体是高度谷氨酸水平或NMDA暴露引起的兴奋性毒性细胞死亡的主要启动子[34]。NMDA 受体介导的兴奋性毒性与多种神经病理学相关[35]。在眼病中，兴奋性毒性与青光眼、视网膜缺血和糖尿病视网膜病变的发病机制均相关[36-37]。Annabelle 等[34]对成年小鼠玻璃体腔内注射NMDA 建立RGCs 变性模型，在损伤后1、7 d 检测到RGCs 为时间依赖性丢失，在使用MS-275 和LMK-235 分别选择性抑制HDAC1/3 和HDAC4/5 后，发现可以阻碍正在进行的RGCs 变性，并将HDAC1/3 和HDAC4/5 鉴定为治疗退行性视网膜疾病的潜在治疗靶点。

4.3 与眼压相关损伤模型

在临床中，导致青光眼视野丧失、视盘突出以及RGCs 变性等病理损害的主要危险因素是眼压升高。故而模拟符合临床眼压特征的慢性高眼压/正常眼压性青光眼动物模型是必要的。谷氨酸/天冬氨酸转运体基因缺失（glutamate/aspartate transporter gene deletion，GLAST-KO）小鼠已被用作构建正常眼压性青光眼（normal tension glaucoma，NTG）小鼠模型，其模型特点为在眼压不升高的情况下发生进行性RGCs 丢失和视神经变性，并表现出包括谷氨酸神经毒性和视网膜氧化应激在内的青光眼病理学特征。Kimura 等[38]研究发现，VPA 治疗可阻碍GLAST-KO 小鼠RGCs 的死亡和视网膜内层变薄，减少视网膜的氧化应激，并刺激与ERK 相关的细胞存活信号通路的激活。Alsarraf 等[39]用高渗盐水注射大鼠单侧眼构建高眼压视神经损伤模型，发现1 周内HDACs 活性显著升高，2周内组蛋白H3 乙酰化显著降低。经VPA 治疗4 周后图形视网膜电图振幅始终维持良好水平，RGCs 密度也保持显著，与对照组无显著差异。基于实验结果认为HDACs 活性升高是眼压升高引起的早期视网膜事件，抑制HDACs 活性可以保护RGCs 免受眼压应激损害。Zaidi 等[40]同样用高渗盐水构建大鼠青光眼高眼压模型，发现Ⅰ类和Ⅱb 类HDACs 活性在第7 d 和第42 d 的视网膜组织中显著增加，且HDACs 的mRNA和蛋白质表达在第42 d 进一步增强。高眼压动物的视力、对比敏感度和模式视网膜电图显著下降。通过δ-阿片受体激动剂（δ-Opioid receptor agonist，SNC-121）早期干预后，Ⅰ类和Ⅱb 类HDACs 活性得到有效抑制，各项指标与模型组比较均显著改善。

4.4 其他视神经损伤模型

Lebrun-Julien 等[41]建立了以RGCs 为靶点的条件敲除HDAC1/2 小鼠，研究HDAC1/2 在轴突切开视神经损伤模型中的作用。发现p53-PUMA 凋亡诱导通路在轴突切开的RGCs 中被强烈激活，特异性HDAC1/2 敲除可损害p53（肿瘤抑制因子）乙酰化状态和减少PUMA（p53 上调凋亡调控因子）的表达从而抑制这一凋亡途径的激活，维持RGCs 的存活。Yoshiki 等[42]用镊子在成年大鼠眼后2 mm 处压碎视神经10 s 建立损伤模型，经TSA 处理后损伤的RGCs 轴突再生。在视网膜外植体中也发现，VPA 能刺激神经轴突向外生长[43]。表明HDACi 不仅具有神经保护作用，还能增加受损神经元的再生潜能。此外，RGCs 的纯化培养物也受益于HDACi（VPA，TSA 和SB）的处理，可减少RGCs 凋亡[44]。在慢性年龄相关性青光眼DBA/2J 小鼠模型中也被证明HDACi 可有效减轻RGCs 特异性Fem1cR3 基因表达的降低[45]，但靶向消融HDAC3 的活性不能保护RGCs 免受轴突变性或体细胞死亡，使用RGFP966 抑制HDAC3 活性可对老年DBA/2J 小鼠神经节细胞层的体细胞丢失提供轻度保护作用[46]。

5 小结

目前对青光眼的治疗仍是药物和/或抗青光眼手术疗法以维持眼压的正常和稳定，所以寻找针对受影响组织的辅助治疗方法是备受关注的。迄今为止，HDACi 对视神经损伤动物模型的研究已显示出治疗青光眼等视网膜退行性疾病的巨大前景。考虑到青光眼RGCs 死亡是随着时间亦步亦趋的，需要在数月或数年内持续治疗，以维持患者视功能。然而这些抑制剂，特别是广谱抑制剂，在高剂量给药时对快速分裂的细胞有毒副作用[47]。所以通过对RGCs 的凋亡机制和各种视神经损伤模型的研究来深入挖掘抑制HDACs 调控神经元存活的各种途径，以及进一步探讨受损RGCs 中每个HDACs的确切生物学机制，以确定哪些HDACs 可作为青光眼等视网膜退行性疾病HDACs 抑制疗法的合适靶点，是未来的研究方向。