漆酶LAC表达与鸭梨果心褐变的关系

2021-01-04王梓宇张引引李月圆李玲尤玲玲李晓雁晋朝闫师杰

中国农业科学 2020年24期

王梓宇，张引引，李月圆，李玲,4，尤玲玲,4，李晓雁,4，晋朝，闫师杰,4

漆酶表达与鸭梨果心褐变的关系

王梓宇1，张引引2，李月圆3，李玲1,4，尤玲玲1,4，李晓雁1,4，晋朝5，闫师杰1,4

（1天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384；2天津农学院园艺园林学院，天津 300384；3山西农业大学食品科学与工程学院，山西晋中 030801；4天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300384；5天津森罗科技股份有限公司，天津 300409）

【】探究在不同成熟度和降温贮藏方式下，表达模式与鸭梨果心褐变的关系，为进一步解析鸭梨果心褐变机制提供理论依据。以鸭梨作为材料，通过对不同成熟度（早采、中采和晚采）的鸭梨进行急速降温（急降）和缓慢降温（缓降）处理，观察贮藏期间鸭梨果心褐变情况，测定漆酶（Laccase，LAC）活性及其基因的相对表达量，研究在鸭梨果心褐变过程中的参与作用。冷藏60 d时，晚采鸭梨出现褐变，晚采缓降处理的鸭梨果心褐变指数为0.32，是同期急速降温处理的2.56倍；在贮藏90 d时，中采缓降处理的褐变指数是0.24，中采急降处理的褐变指数仅为0.01。各个处理组在贮藏期间LAC活性多数表现为先逐渐升高后下降的趋势，晚采的果实在贮藏60 d时出现活性高峰，褐变发生；早采和中采鸭梨LAC活性高峰均在90 d时出现，褐变程度低于晚采鸭梨。在贮藏期间，缓慢降温处理的LAC活性高于急速降温处理。鸭梨和表达量呈先上升后下降的趋势，表现为先下降后上升再降低的变化趋势；中采、晚采鸭梨在贮藏60 d时，和表达量最高。与缓慢降温相比，急速降温处理减少了鸭梨果心褐变的发生。在整个贮藏期间，LAC活性呈先上升后下降然后又上升的趋势，其峰值时的活性高低次序为：晚采>中采>早采，这与果心褐变趋势一致；在鸭梨果心褐变过程中上调表达。相比缓慢降温处理，急速降温处理具有较低的、和表达量。急速降温结合适时采收能够抑制的上调表达，减少鸭梨果心褐变发生。

鸭梨；果心褐变；降温方式；漆酶；

0 引言

【研究意义】鸭梨（Rehd cv. Yali）是我国北方栽培的主要梨品种，具有果肉细嫩多汁，香气诱人，耐贮运等优点[1]，深受人们喜爱。但鸭梨果心在采后贮藏过程中易出现黑心，即近果心部位发生褐变，严重影响其贮藏品质和食用口感，制约其销售，造成经济损失。果实采后果心褐变速度和程度是影响鸭梨果品品质和货架期寿命的重要因素。褐变依据采收期不同，可分为早期褐变和晚期褐变[2]。早期褐变原因通常被认为是冷敏性褐变，晚期褐变多认为是衰老型褐变[3]。鸭梨果心褐变是一个复杂的调控过程，是各种相关酶和基因共同调控的结果。因此，了解其内在调控机制，为研究开发鸭梨采后保鲜新途径提供理论和依据。【前人研究进展】酶促褐变是引发鸭梨褐变的首要原因[4]。鸭梨采后贮藏中，果实逐渐衰老，硬度下降，膜脂过氧化作用加强，对膜系统造成损伤，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）及其底物酚在细胞内的区域化被打破，酚与PPO接触反应，发生酶促褐变[5-7]。PPO与酶促褐变密切相关，有氧环境下，酚类物质与PPO反应生成醌类物质，醌类物质可进一步被氧化成黑色聚合物，也可自身聚合，还会与氨基酸等大分子络合产生褐色物质，在果蔬组织内不断积累，发生褐变[8]。何利华[9]研究证实，鸭梨中的PPO同工酶与鸭梨果实褐变密切相关，并采用RT-PCR技术，克隆得到一条1 780 bp的产物，其与鸭梨的同源性高达99%。这为进一步研究鸭梨基因家族提供了理论基础。李晓丹等[10]研究了鸭梨果肉中的脂氧合酶（LOX）同工酶，不同处理下鸭梨贮藏中果实LOX酶活性与LOX酶谱带不同，其中9条与果肉褐变有关，主酶带有3条，分别是B、C、G。樊晓岚等[11]研究降温方式下脂肪酸去饱和酶基因和表达变化发现，急速降温增加了FAD和LOX活性与基因表达量，使鸭梨机体受到冷害，导致果心不饱和脂肪酸含量与脂肪酸不饱和度升高，促进了果心的褐变。漆酶（Laccase，LAC）是具有催化酚类结构物质和芳香族氨基酸的一种含铜多酚氧化酶[12-13]，与儿茶酚结构类似的酚类化合物都可以作为底物被漆酶氧化，而儿茶酚是鸭梨、苹果、柿子等水果的褐变底物之一[14]。FANG等[15]研究证实漆酶降解花色苷，使褐色物质在荔枝果皮中生成并积累，促进果皮褐变。蒋跃明[16]研究发现，漆酶主要催化荔枝果皮中的多酚类化合物，表儿茶素等，导致果皮黑色素积累，褐变加重，漆酶活性与荔枝果皮褐变率呈显著正相关。植物中漆酶通常由多个基因共同调控，有学者已在拟南芥中共发现17个漆酶基因[17]。此外，亚麻[18]、甜高粱[19]、水稻[20]和杨树[21]等也发现了漆酶基因家族。【本研究切入点】国内外鸭梨褐变的研究中未出现过与漆酶导致褐变有关的内容，本研究通过对转录组数据的分析，结合其他果蔬的褐变机理，在鸭梨褐变过程中挖掘出不同于以往的引起褐变的关键酶—漆酶，并探究不同处理下漆酶对鸭梨褐变过程的影响。【拟解决的关键问题】结合褐变指数、LAC活性及相对表达量三者之间的关系，深入探究鸭梨果心褐变的分子机理，旨在为探索在鸭梨果心褐变中的调控作用提供理论依据，为今后更加深入解析褐变机理奠定分子基础。

1 材料与方法

1.1 材料

鸭梨采自河北省深州市大城北村，挑选大小均匀，无机械伤、无虫害的果实为材料。采摘时间：2017年9月6日、9月16日和9月26日，分别称为早采、中采和晚采鸭梨。采摘当天运回冷库。

早采、中采和晚采鸭梨分别采用急速降温（急降）和缓慢降温（缓降）两种处理方式，急速降温指去除田间热的鸭梨直接放入（0±1）℃贮藏；缓慢降温是指将鸭梨预冷后置于12℃冷库中，每5 d降2℃，用30 d时间降为0℃。将采收期与降温方式结合起来分为早采急降（早急）、早采缓降（早缓）、中采急降（中急）、中采缓降（中缓）、晚采急降（晚急）、晚采缓降（晚缓）6个处理组，每个处理10箱，每箱约150个果。每隔30 d，从每箱中取出3个果实，10箱共取30个果实，观察并记录鸭梨果心褐变情况，用液氮对鸭梨果心组织样品进行速冻，置于-80℃中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 果心褐变指数的测定参考YAN等[22]的方法，褐变指数计算方法为褐变级别与该级别果的乘积除以最高褐变级别与检查总果数的乘积。

1.2.2 LAC活性测定参照FLOCH等[23]的方法，略作修改。称取4 g鸭梨果心冻样，冷冻磨成粉末状后转移至试管中，加入醋酸钠缓冲液（pH 4.5）100 mL，震荡后静置15 min，过滤离心得到酶粗提液。酶活性测定：取粗酶液0.1 mL，加入2.5 mL醋酸钠缓冲液（pH 4.5）混匀后，加入0.4 mL ABTS溶液，反应30 s后开始计时，每15 s测定一次OD420值的变化。设置3次重复。

1.2.3 果心总RNA提取与定量测定从5个鸭梨果心组织混合冻样中，称取1 g，使用Probe Gene MM032 RNA提取试剂盒进行总RNA提取；提取后利用1%琼脂糖凝胶对RNA的完整性进行检验。然后取1 μg总RNA，利用宝生物RR047A试剂盒进行反转录，合成cDNA。

以鸭梨中肌动蛋白（Actin）基因（NW_ 008988406.1）作为内参基因[24]。根据引物设计原则，使用Primer 5设计、、引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如表1。依据樊晓岚等[11]的基因定量检测方法，用荧光定量PCR仪（CFX-Connect）确定荧光定量PCR反应体系为：SYBR Premix Ex TaqTMII 12.5 μL，Forward Primer 2 μL，Reverse Primer 2 μL，cDNA 1μL，dH2O 7.5 μL（反转录之后cDNA已经定量，实时定量取等体积cDNA，即等浓度）。反应程序为：95℃预变性 30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共计30个循环。最后以鸭梨为内参基因，以初始（贮藏0 d）样品中相关基因表达量为标尺，采用2−ΔΔCt法计算基因相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物

1.3 数据分析

数据采用Excel 2010软件进行统计分析，SPSS17.0进行差异显著性检验，＜0.05为差异显著，＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 不同处理对鸭梨贮藏期果心褐变指数的影响

贮藏过程中，用褐变指数表示鸭梨果心褐变变化情况。由图1可知，随着贮藏时间的延长，不同处理组鸭梨果心褐变指数均呈增长趋势。贮藏60 d时，急速降温和缓慢降温的晚采鸭梨处理组以及缓慢降温的中采鸭梨处理组均出现了褐变，褐变指数分别约为0.1、0.2和0.1；而急降和缓降的早采处理鸭梨及中采急降处理鸭梨在90 d才出现轻微褐变，较中缓、晚急和晚缓处理组褐变晚出现约30 d。贮藏120 d后，急降和缓降早采处理鸭梨组褐变指数显著低于其他4个处理组（<0.05），且褐变指数一直处于较低水平；早急和早缓两个处理组相比，急速降温处理褐变指数显著低于缓慢降温处理组（<0.05）。贮藏到后期，晚采缓降处理组褐变指数维持在较高水平，且在210 d到达峰值（0.64）。在整个贮藏期间，晚采鸭梨果心褐变指数最高，中采次之，早采最低。缓降的鸭梨果心褐变指数显著高于急降处理（<0.05）。说明早采鸭梨果心褐变程度轻，缓慢降温加速褐变。

2.2 不同处理对鸭梨果心LAC活性的影响

由图2可知，各个处理组在贮藏期间LAC活性先逐渐升高后下降，晚采鸭梨在60 d时出现活性高峰，急速降温和缓慢降温处理峰值分别为6.22和7.32 μmol·h-1·mL-1，早采和中采鸭梨活性高峰均在90 d出现，晚采缓降处理的峰值最大，其果心褐变程度也最高。不同成熟度鸭梨缓慢降温处理的LAC活性比急速降温的活性高，急速降温可以很好地抑制鸭梨采后果心的LAC活性，从而抑制鸭梨果心褐变。因此，晚采的果实LAC活性较高，尤其晚采缓降处理鸭梨的活性最高，果实褐变最严重。

*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）

图2 不同处对理鸭梨果心LAC活性的影响

2.3 不同处理对鸭梨果心褐变相关LAC表达的影响

不同处理的鸭梨在贮藏期间的表达量如图3所示。整体上，鸭梨和表达量呈先上升后下降的趋势，多数情况下呈先下降后上升再降低的趋势。随着贮藏时间的延长，缓慢降温处理鸭梨果心相对表达量先上升后下降，最后又呈现上升趋势。晚采急速降温处理的鸭梨果心和的表达量在贮藏60 d时突然升高。中采和晚采处理的鸭梨在60 d时表达量达到最高。急速降温处理显著降低的表达量，中采处理果实贮藏60 d时，急速降温果表达量仅为0.37，而缓慢降温处理的为1.36，中采鸭梨两种降温方式表达差异较大。在不同成熟度鸭梨中，表达量表现为：早采<中采<晚采；和表达量变化趋势和LAC活性变化基本一致。

不同小写字母表示差异显著（P＜0.05） Different lowercase letters indicate significant difference (P＜0.05)

3 讨论

酚类物质、酶、氧是导致酶促褐变必不可少的3个因素，正常情况下，由于细胞具有空间结构性，酶与底物无法接触，不会发生褐变，但当植物遭受逆境伤害时，细胞膜受到破坏，三者接触引发褐变反应。贺立红等[25]和霍君生等[6]对鸭梨的研究也表明果实褐变和细胞膜系统的稳定性相关。目前大多数研究都认为，果实褐变的根本原因是随着果实的衰老和受低温等外界因素的胁迫伤害，活性氧自由基清除酶系统的活性下降，使活性氧自由基含量增加，打破植物体内动态平衡，进而加剧细胞膜的破坏，使酚类物质与PPO接触，形成褐色聚合物，从而加剧褐变[26-27]。PPO是酶促褐变发生的关键酶，其包括3种类型，即单酚氧化酶、双酚氧化酶以及漆酶；不同果实的PPO性质不同，如枇杷果实PPO能氧化邻位酚、绿原酸等，但不能氧化对位酚、间位酚，属于双酚氧化酶[28]；而荔枝果皮、鸭梨果心、香梨果皮PPO能氧化邻苯二酚和对苯二酚，但不能氧化一元酚和间苯二酚，表现为漆酶的特性[29]。漆酶作为多酚氧化酶的一种，在果实的褐变过程中起着重要作用。前人研究发现，在严重褐变的荔枝果皮中过度表达，且随果皮褐变指数升高而升高[30]。龙眼果皮中表达量上升，其漆酶活性升高，褐变程度加剧[31]。

漆酶主要存在于完整的细胞区域，包括液泡、叶绿体、白色体等中[32]，在贮藏初期果实中的LAC主要以结合态形式存在，当植物受到逆境伤害或随着贮藏时间的延长，果实逐渐走向衰亡时，LAC和底物的区域被打破，LAC便从细胞膜上脱离出来，转变为参与氧化反应的游离态，增强了LAC活性，活性升高，加速了酚类物质的氧化，从而导致褐色物质的积累，加速了褐变[29]。本研究中LAC对鸭梨果心褐变也表现为促进作用，在急速降温和缓慢降温处理贮藏过程中，LAC活性均呈先升后降然后又轻微上升的趋势。结合果心褐变指数变化分析，晚采缓慢降温处理果在60 d时褐变指数从0变为0.2，褐变发生。可能是由于在贮藏60 d时，LAC活性达到最大，加速了酚类物质的氧化，进而导致褐色物质的产生，褐变发生，而急速降温果褐变指数显著低于缓慢降温处理组，这与急速降温处理果LAC活性低于缓慢降温处理果关联密切。本研究发现，晚采鸭梨和表达量均在60 d达到最大，这与果心褐变出现的时间一致，且和表达量变化趋势和LAC活性基本一致，这也表明导致了鸭梨果心褐变的发生。中采鸭梨急速降温和缓慢降温处理果表达量差异显著，说明对降温方式比较敏感，缓慢降温可诱发表达，加速褐变。这与周一鹏[32]在柑橘漆酶家族中作用模式研究一致。表达量先下降再上升然后又降低，可能参与果实后期的褐变过程，需要进一步的研究证实。

4 结论

急速降温处理较缓慢降温处理有助于减少鸭梨贮藏期间果心褐变发生。不同采收期果实的果心褐变程度表现为：晚采>中采>早采。晚采果实的LAC峰值较高，尤其是结合晚采缓降处理时活性最高，早采果实的LAC活性处于较低水平；急速降温能保持较低的LAC活性，以及较低的、和表达量，减少果心褐变。表明鸭梨（、和）表达水平和酶活性变化与果心褐变密切相关。

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Relationship Between LAC Gene Expression and Core Browning of Yali Pear

WANG ZiYu1, ZHANG YinYin2, LI YueYuan3, LI Ling1,4, YOU LingLing1,4, LI XiaoYan1,4, JIN Zhao5, YAN ShiJie1,4

(1College of Food Science and Biological Engineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384;2College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384;3College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801, Shanxi;4Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing,, Tianjin 300384;5Tianjin CNRO Science & Technology CO. ,Ltd., Tianjin 300409)

【】 The aim of this study was to explore the relationship between LAC gene expression patterns and core browning of Yali pear under different maturity and cooling storage methods, so as to provide a theoretical basis for further analysis of the mechanism of Yali core browning.【】Using Yali pear as the material, the Yali pears of different maturity levels (early harvesting, middle harvesting and late harvesting) were treated with rapid cooling and slow cooling to observe the core of the pear during storage. For browning situation, the activity of LAC and the relative expression of LAC gene were determined, and the role of LAC gene in the browning process of Yali pear core was studied.【】 When the Yali pear samples were refrigerated for 60 days, the late-harvested pears browned, and the browning index of late-harvested pears gradually decreased was 0.32, which was 2.56 times the rapid temperature drop during the same period; after 90 days of storage, the middle-harvested browning index decreased slowly, and the index was 0.24, and the browning index of the medium mining was only 0.01. During the storage period, the LAC activity of each treatment group increased gradually and then decreased. The late harvested fruits showed a peak activity and browning occurred after 60 days of storage. The peak of LAC activity of early harvesting and middle harvesting Yali pears appeared in 90 days, and the degree of browning was lower than that of late harvesting Yali. During the storage period, the activity of slow cooling LAC was higher than that of rapid cooling. The LAC14 and LAC7 gene expressions of Yali pears increased first and then decreased. LAC6 realized a change trend of first decline, then increased and then decreased; the expression of LAC14 and LAC7 genes reached the highest when the middle and late harvested pears were stored for 60 days.【】Compared with slow cooling, rapid cooling treatment reduced the browning of Yali fruit core. During the whole storage period, the activity of LAC showed a trend of rising first, then falling, and then rising again, and the order of activity at its peak was: late harvesting>medium harvesting>early harvesting, which was consistent with the browning trend of the core.LAC was in the Yali fruit Up-regulated expression during heart browning. The rapid cooling was slower than the slow cooling, and the expression of LAC7, LAC14 and LAC6 genes was lower. A timely harvesting with the rapid cooling could inhibit the up-regulated expression of LAC and reduce the browning of Yali pear core.

Yali pear; core browning; cooling method; laccase; LAC gene