外泌体在神经退行性疾病中的作用
2021-01-03许鹏飞综述张红菊2审校
许鹏飞综述, 张红菊,2审校
神经系统退行性疾病发病率逐年上升,仍缺乏修饰性治疗策略。外泌体是一种由活体细胞通过胞吞-胞吐方式释放的小囊泡,具有细胞通讯作用,在神经系统退行性疾病的发生、发展过程中具有重要作用;因此,在疾病的早期诊断和治疗上具有重要研究价值。本文针对外泌体与神经系统退行性疾病相互关系的研究综述如下。
1 外泌体概述
1983年,Pan和Johnstone团队首次在绵羊网织红细胞成熟过程中,发现了一种与转铁蛋白释放到细胞外途径相关的小囊泡,并于1989年定义为外泌体[1]。最初,外泌体被认为是一种清除细胞代谢废物的运输工具,越来越多的研究表明,外泌体在细胞通讯过程中起重要作用,能够反映并影响细胞的生理、病理状态,其中某些分子成份与疾病的发生、发展、治疗有密切联系[2]。
1.1 外泌体的释放 细胞外囊泡根据其直径大小可分为三种,分别为凋亡小体(50~5000 nm)、微泡(100~1000 nm)、外泌体(30~150 nm)。外泌体与细胞凋亡过程中产生的小囊泡不同,外泌体只能由活细胞分泌,且能被体内多种类型细胞分泌,广泛存在于各种体液中[3]。外泌体通过胞吞-胞吐方式由亲本细胞释放;首先,胞膜内化形成胞内体,胞内体聚集形成多泡体(Multivesicular Bodies,MVBs),MVBs与亲本细胞膜融合,通过胞吐作用将外泌体排出细胞。多种因素通过不同途径影响外泌体释放,小GTP酶蛋白的 RAB 家族(RAB27、RAB5A、RAB9A、RAB2B、RAB11、RAB35)通过影响MVBs膜与细胞膜的融合促进外泌体分泌[4]。
1.2 外泌体的通讯作用 外泌体与靶细胞交流通过以下方式:(1)外泌体膜与受体细胞膜相互融合,释放所携带物质进入受体细胞。(2)通过配体受体之间相互作用激活信号通路。(3)细胞通过胞吞作用将整个外泌体内化后,与溶酶体融合,将所携带物质释放入受体细胞。此外,内化后的外泌体还可以与MVBs融合,再次被分泌出细胞外[5]。
1.3 外泌体的组成 外泌体由构成性分子和运载分子共同组成,构成性分子取决于释放外泌体的亲本细胞种类,其外侧双层膜结构主要成分为脂质和蛋白质。外泌体的构成及运载分子包括RNA、脂质及蛋白质,其中蛋白质包括四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、Flotillin、Alix、TSG101、和热休克蛋白 (Hsc70、Hsp90) 等[6],四次跨膜蛋白常被作为外泌体鉴定标志物。Flotillin主要用于膜蛋白之间的相互交流与信号转导,研究表明Flotillin可作为阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)诊断的新型标志物[7]。外泌体还携带有mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA,并转移至其它细胞中发挥生物学调控作用,成熟miRNA的一条单链可与某些蛋白质相互作用,形成RNA诱导沉默复合物(RISC)[8]调节蛋白质表达。不同外泌体的运载分子不尽相同,这与外泌体亲本细胞和外泌体形成过程中各种生理和病理条件有关。
2 外泌体与神经系统退行性疾病
2.1 外泌体与α-突触核蛋白病 α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)是大脑中大量存在的一种可溶性蛋白质,尚不明确其健康状态下的功能,但错误折叠和纤维状聚集的α-syn沉积在中枢及周围神经系统中将导致一系列α-突触核蛋白病发生,如帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、路易体痴呆(Dementia with Lewy bodies,DLB)等。PD是仅次于AD的第二大类神经系统退行性疾病,65岁以上人群发病率为2%[9]。其病理特征是α-syn构成的路易小体(Lewy Body,LB)在神经元胞体和轴突内沉积[10]。目前认为神经元功能受损甚至死亡是由α-syn寡聚体引起的。α-syn可被分装入外泌体释放到细胞外环境,导致类似于朊病毒样的病理传播。实验发现,PD患者血清外泌体中α-syn含量多于正常对照组[11],且α-syn以寡聚体形式存在于血清外泌体中;但PD患者脑脊液总α-syn含量低于正常对照组,可能是中枢神经系统由于某种保护机制向血液系统中转运α-syn增加,其具体机制需进一步研究。将PD患者血清外泌体接种细胞,可致其表达α-syn单体及寡聚体增加;且用PD患者脑脊液外泌体接种健康小鼠,会使小鼠脑脊液中α-syn的表达水平呈剂量依赖型增加[12,13],故PD患者血清和脑脊液外泌体可以促进靶细胞中α-syn形成。依赖于完整的外泌体传播途径,与游离α-syn相比,外泌体中α-syn更容易被受体细胞内化,在神经系统传播中,毒性更大。
外泌体形成和分泌过程受自噬-溶酶体途径(ALP)调节。ALP异常时,蛋白质清除能力下降,并影响PD及DLB的发生发展;ALP受损将导致细胞内α-syn寡聚体的清除效率降低,引起α-syn寡聚体向细胞外释放增加,导致外泌体中α-syn寡聚体在细胞间传播,加速疾病进展[14]。
小胶质细胞被认为是传播α-syn寡聚体导致PD进展的潜在载体。用α-syn处理BV-2小鼠小胶质细胞,发现α-syn可以诱导小胶质细胞分泌外泌体增加,将此外泌体与神经元细胞共培养可致神经元细胞凋亡增多,说明外泌体在小胶质细胞介导PD的进展过程中扮演重要角色[15]。将DLB患者脑组织的外泌体接种细胞,可观察到α-syn在细胞中聚集[16],接种至健康小鼠大脑中,会导致α-syn在神经元细胞中聚集[17],说明DLB患者脑组织源性外泌体可使DLB病理播散,加重病情。研究发现,处于进展期的DLB患者脑脊液外泌体α-syn水平较高,且α-syn含量与MMSE得分呈负相关[13],这表示DLB患者脑脊液外泌体α-syn含量可能与疾病活动有关,且影响患者的认知水平。虽然PD患者脑脊液外泌体接种小鼠会导致小鼠脑脊液中α-syn含量增加,但尚未观察到PD患者脑脊液外泌体α-syn含量与UPDRS分期的相关性。
2.2 外泌体与AD AD的病理特征为β-淀粉样蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)沉积形成神经炎性斑,及过度磷酸化Tau蛋白在神经元内形成神经原纤维缠结。AD患者的病理斑块中有大量的Aβ及外泌体特定标志蛋白Alix存在,Rajendran等发现Aβ可通过外泌体分泌至细胞外,并证实了外泌体具有在细胞间传播毒性Aβ和高磷酸化Tau蛋白的能力,当外泌体途径被阻断可减弱Aβ聚集和传播[18,19]。有研究报告:小胶质细胞减少可以抑制Tau蛋白增殖,小胶质细胞外泌体合成受到抑制,可降低Tau蛋白的繁殖与传播[20],这说明小胶质细胞外泌体在AD的发生发展中同样具有重要研究价值。另有研究发现:轻度至重度(Braak 3-6期)的AD患者,脑脊液外泌体中磷酸化Tau蛋白浓度显著高于早期阶段(Braak0-2期)[21],这表明外泌体相关的磷酸化Tau蛋白与疾病的进展有关。
3 外泌体在神经系统退行性疾病中的应用价值
外泌体存在于各种体液中,便于获得,其成分特异,所携带物质不仅能反映亲本细胞的生理和病理状态,并且外泌体可保护其携带的miRNA、蛋白质等稳定存在,不被核酸酶和蛋白酶降解,因此,可成为神经系统退行性疾病的诊断重要标志物;因其具有穿过血脑屏障的功能,对其进行修饰、装载,将成为药物治疗的载体,可在神经系统退行性疾病的治疗中发挥重要的作用。
3.1 外泌体与神经系统退行性疾病的诊断 神经系统退行性疾病起病隐匿,早期无明显临床症状,但生物特性的变化已经在外泌体中体现,因此,外泌体的改变可为疾病早期诊断提供依据。目前PD的诊断多依赖于临床症状,但当纹状体中70%至80%和黑质中50%的多巴胺能神经元丢失时[22],才出现运动症状,因此,PD早期诊断的生物学标志物有待进一步明确,人们正在尝试从脑脊液、血液、尿液中提取外泌体及外泌体携带物质进行PD早期诊断的探索。
与脑脊液相比,血液和尿液样本更易获得,但外周血中血小板和红细胞会产生大量的α-syn,若制备样本时发生溶血则影响血浆外泌体中α-syn检测结果。在PD患者尿液外泌体中可检测到与PD相关的LRRK2蛋白[23],但由于LRRK2在人体内表达多变,不能得到稳定的检测结果,因此不能用于PD的早期诊断。DJ-1是一种由189个氨基酸构成的蛋白质,具有抑制α-syn聚集的作用,有研究发现男性PD患者尿液外泌体中DJ-1与正常人存在明显差异[24],但研究样本量较小,能否成为未来诊断标志物仍需进一步验证。
脑脊液可直接反映脑内病理变化,故使用脑脊液外泌体样本对疾病诊断更精确,但不易获得。对脑脊液外泌体miRNA分析发现PD患者脑脊液外泌体较正常对照组有16个miRNA表达上调,11个miRNA表达显著下调,而miR-153、miR-409-3p、miR-10a-5p显著过度表达[25],这些差异有望成为PD早期诊断标志物。
Aβ在脑内沉积是一个长期缓慢过程[26],对AD临床前期诊断有助于早期干预疾病发生发展。研究表明AD患者血浆脑源性外泌体中总Tau蛋白、P-T181-tau、P-S396-tau和Aβ1-42水平均显著高于正常对照组,在认知正常的高危患者中可检测到磷酸化Tau蛋白、P-S396-tau和P-T181-tau,这些改变可追溯到AD诊断的10 y前。动态检测发现,从临床前的高危人群到AD确诊,患者血浆外泌体Aβ1-42水平由逐渐升高到显著增高[27],因此,血浆外泌体Aβ1-42具有刻画AD进展的价值。
外泌体的标志蛋白Flotillin是位于外泌体脂筏上的疏水性蛋白,可通过影响Ca2+稳态、线粒体功能参与AD的发病。一项临床研究发现:与非AD人群相比,AD患者脑脊液和血清中Flotillin水平显著下降,用11C-匹兹堡化合物B (11C-PiB)正电子发射断层摄影(PET)成像技术分析Aβ沉积,发现血清Flotillin水平与Aβ沉积负相关[28],这表明血清Flotillin水平可用来评估Aβ沉积,可用于早期诊断。
3.2 外泌体与神经系统退行性疾病的治疗 外泌体经改造后可回输至自体,减少因药物载体带来的免疫反应,提高治疗的安全性,且由于其能够通过血脑屏障,故可用外泌体作为药物载体对神经系统退行性疾病进行靶向治疗。中国研究团队通过饱和溶液孵育法,成功有效的将多巴胺装载入血浆外泌体中,通过动物实验证实,装载入血浆外泌体的多巴胺透过血脑屏障,被成功传送至大脑的黑质和纹状体,且多巴胺在脑内分布增加了15倍以上[29]。有研究团队将过氧化氢酶(强效抗氧化剂)在不改变外泌体结构的情况下装载入外泌体,携带过氧化氢酶的外泌体透过血脑屏障,富集在神经元细胞和小胶质细胞[30],发挥强大的保护作用。此外,有研究将抗α-syn的shRNA微环(shRNA-MCs)装载入被狂犬病毒糖蛋白肽修饰过的外泌体(RVG-exosome),并通过尾静脉接种PD小鼠,发现PD小鼠脑中α-syn表达减少、聚集水平降低,且黑质致密部多巴胺能神经元丢失减少,临床症状改善[31]。最近有研究将含有中性内肽酶(NEP)和胰岛素降解酶(IDE)活性的间充质干细胞外泌体注射AD模型小鼠,发现小鼠的Aβ斑块沉积减少[32]。Wang H等将姜黄素(curcumin,cur)诱导的外泌体(exosome-cur)注射入冈田酸(Okadaic Acid,OA)诱导Tau过度磷酸化的AD小鼠,观察到exosome-cur可以通过AKT/GSK-3β通路抑制Tau蛋白的磷酸化[33],且小鼠的认知功能得到改善。上述的研究结果将为PD、AD及其他神经系统退行性疾病的治疗提供新的方法。
4 小 结
随着人口老龄化加剧,神经系统退行性疾病发病率越来越高,给患者、家庭及社会带来巨大影响,探究其病理,对其进行早期诊断、早期干预成为当下解决问题的重点。对外泌体进行探索发现其与神经系统退行性疾病有巨大联系,虽然目前仅在研究阶段,实际应用还面临诸多困难,但其仍不失为一种有前途的方法。