炎性小体在缺血性脑卒中的研究进展

杨越旺综述， 胡霞敏审校

脑卒中是临床常见的心脑血管疾病之一,其中缺血性脑卒中在卒中占比高达60%～80%，高致残率、高致死率特点显著[1]。其多发于60岁及以上老年人群。现研究发现，缺血性脑卒中患者人群逐渐呈年轻化趋势。其主要原因是由于血管栓塞引起脑血流量减少、脑组织血氧供应不足，刺激内皮细胞和循环白细胞，激活血小板和凝血级联反应，迅速启动凝血系统，引起微血管阻塞，持续缺氧可降低一氧化氮的产生水平和血压，并使血小板进一步粘附、聚集和血管收缩，逐渐形成缺血-闭塞-缺血的恶性循环。炎性小体是宿主防御反应的重要组成部分，它能够识别病原体相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)和损伤相关的分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMP)，并介导促炎因子的水解和释放，从而保护人体免受病原微生物和内源性危险信号的侵害。激活后，炎性小体分泌成熟的白细胞介素-1β((interleukin-1β，IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)，引起炎症反应并参与各种无菌炎症性疾病的过程[2]。炎性小体在缺血性脑卒中诱导的炎症反应中起着重要的调控作用。本文通过查阅炎性小体在缺血性脑卒中的作用的相关文献，对炎性小体在缺血性脑卒中的作用及作用机制等方面进行综述，为其后续药物开发和临床治疗提供理论参考依据。

1 缺血性脑卒中与炎症反应

炎症反应是机体先天免疫反应，对清除有害刺激并促进组织修复的启动发挥重要作用。卒中触发的炎症反应贯穿整个卒中过程，从卒中开始后不久内皮细胞的激活，到卒中后几天到几个月的损伤后修复阶段，是影响神经元死亡的关键因素之一。然而，过度激活的炎症反应对机体会造成严重损伤。脑缺血发生时，被激活的细胞(包括神经元、星形胶质细胞和内皮细胞)释放IL-1β、IL-6和IL-18促炎细胞因子，诱导神经元和胶质细胞死亡。中枢神经系统(central nervous system，CNS)中小胶质细胞首先被激活，并分泌大量炎症介质，伴随着缺血区炎症反应的加剧、血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的破坏及多种DAMPs的释放，共同诱导外周免疫细胞向病灶及周边迁移，并广泛地参与到缺血性脑卒中的炎症及免疫反应进程。Dai等[3]研究发现D-香芹酮通过抑制大鼠脑缺血再灌注诱导的炎症反应，从而减轻脑缺血再灌注所致海马区和皮质区的损伤；同时，释放的促炎细胞因子可以诱导粘附分子的表达，如细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管细胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule，VCAM)、选择素(如P-选择素，E-选择素)和整联蛋白。这些黏附分子对于免疫细胞，特别是中性粒细胞和单核/巨噬细胞在再灌注期间渗透到缺血区至关重要。但又往往会导致缺血再灌注损伤的二次损伤。此外，激活的神经元和神经胶质细胞释放单核细胞化学抑制剂蛋白1(MCP-1/CCL2)，促进白细胞向受损组织迁移。然而，最近的一项研究表明[4]，白细胞在神经及血管中的积累与增加的血管渗透性和内皮细胞粘附分子的表达增强无空间相关性。尽管缺血再灌注损伤的机制仍未阐明，但研究表明白细胞渗透可以释放各种细胞毒性剂，包括额外的促炎细胞因子(即IL-1β，IL-6等)，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)产生的一氧化氮。这些MMP可能会对细胞外基质和BBB造成损伤，从而加剧脑水肿及出血，最终导致神经元和胶质细胞死亡[5]。

2 炎性小体与缺血性脑卒中

炎性小体由受体蛋白、ASC和Pro-caspase-1 3个部分构成，目前研究较多的模式识别受体为核苷酸结合和寡聚结构域样受体(nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptors，NLRs)和黑色素瘤因子2样缺乏受体(absent in melanoma 2-like receptors，ALRs)。NLR家族划分为5个亚型:含酸性反式激活结构域的NLRA、含杆状病毒抑制剂重复的NLRB、含半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶募集结构域(caspase-activating and recruitment domain，CARD)的NLRC(NOD1、NOD2、NLRC3～5)、包含蛋白结构域的NLRP(NLRP1～14)和结构域未知的NLRX。ALR家族分为AIM2蛋白和γ干扰素诱导蛋白16(IFN-γ inducible Protein16，IFI16)蛋白。NLRP1、NLRP3、NLRC4、和AIM2是目前研究较广泛的炎性小体。研究报道表明，核苷酸结合寡聚结构域样受体(NLR)含吲结构域(NLRP)在缺血性卒中患者炎症反应过程中起着重要作用。

2.1 NLRP1 NLRP1炎性小体由NLRP1受体、ASC和Pro-caspase-1组成，是NLRs家族成员之一，并且在脑组织中高度表达。NLRP1受体的特征在于5个结构域：N-末端PYD(吡林)结构域、NACHT(NAIP，CIITA，HET-E和TP1)结构域、LRRS、FIIND和C末端CARD域。当NLRP1受体激活时，FIND结构域被自动切割。Cao等[6]研究表明NLRP1是miR-9a-5p的靶基因，参与了NLRP1炎性小体介导缺血性损伤诱导的炎症反应。miR-9a-5p过表达下调NLRP1；miR-9a-5p的过表达不仅降低了NLRP1、Asc和Pro-caspase-1的水平，同时降低了IL-1β和IL-18的水平，提示过表达miR-9a-5p可改善缺血性卒中后脑损伤。

2.2 NLRP3 NLRP3炎性小体是由NLRs家族成员之一的NLRP3受体、ASC及Pro-caspase-1组成。N末端PYD、中央NACHT和C末端LRR这3个结构域是NLRP3受体结构特征。N末端PYD结构域有利于与适配器蛋白ASC的下游双配体PYD-PYD的偶联。NACHT结构域调控NLRP1和NLRP3受体激活，一旦激活即引起寡聚并形成炎性小体的中心核心，这是一个ATP依赖的过程[7]。LRR结构域被认为与配体感知和自身调节有关[8]。Ma等[9]研究注射用丹酚酸可通过抑制NLRP3小胶质细胞炎性小体激活，促进小胶质细胞表型由M1向M2转变，减少神经元凋亡，进而发挥神经保护作用。Yin等[10]研究证实TET2通过TUG1去甲基化和调节TUG1/miR-200A-3p/NLRP3通路参与了脑缺血再灌注诱导的炎症反应。Sun等[11]发现低密度脂蛋白受体(LDLR)调节NLRP3介导的缺血性卒中后神经元焦亡和神经炎症，提示LDLR在急性脑缺血损伤的神经炎性反应中可能是潜在的治疗靶点。

NLRP3炎性小体的组装和下游信号的激活依赖于两个与细胞损伤相关的互补信号：其中一个启动信号是通过核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated Pro-tein kinase,MAPK)信号通路实现的，上述通路可上调NLRP3炎性小体复合体蛋白和前体IL-1β和前体IL-18的表达[12]；另外一个互补信号可介导NLRP3激活和ASC磷酸化，从而触发NLRP3炎性小体的组装、caspase-1的活化以及Pro-IL-1β和Pro-IL-18的加工，最终引起 IL-1β和IL-18的分泌。

2.2.1 NLRP3炎性小体活化的启动调控 在静息状态下，NLRP3、Pro-IL-1β和Pro-IL-18在细胞中的表达量较低，无法直接组装或活化NLRP3炎性小体，因此启动信号，特别是NLRP3相关蛋白的上调是激活NLRP3炎性小体所必需的。Fann等[13]的研究发现静脉注射免疫球蛋白制剂可以减少NF-κB和MAPK信号通路的激活，导致NLRP3炎性小体的表达和活化降低，表明NF-κB和MAPK信号通路在调节缺血条件下原代皮质神经元和脑组织中NLRP3炎性小体的表达和激活方面发挥着关键作用。

2.2.2 NLRP3炎性小体活化的激活调控 在激活启动信号后，接头蛋白ASC招募NLRP3蛋白，形成NLRP3炎性小体复合体。目前，NLRP3炎性小体有多种激活机制，包括K+外流、ROS过量产生、线粒体功能障碍、Ca2+超载和溶酶体破裂等。

在细胞内外因子中，K+外流在激活NLRP3炎性小体方面起着重要作用[14]。这种位于细胞表面的非选择性K+阳离子通道能够依赖三磷酸腺苷的结合改变细胞内的离子含量，激活下游信号，诱导IL-1β的成熟和分泌。研究表明，与其他已知刺激相比，下调细胞内K+水平对于激活NLRP3炎症小体通路是必不可少的，突出K+外流在这一过程中的重要作用。嘌呤能离子通道型受体7(purinergic ligand-gated ion-channel 7receptor,P2X7R)是与K+外流相关的受体之一，其激活可能通过ATP诱导促炎细胞因子的释放并放大缺血性损伤。Ye等[15]研究发现P2X7R、NLRP3炎性成分和裂解的caspase-3在卒中后缺血脑组织中的表达显著增强。然而，在用 P2X7R 拮抗剂(BBG)或NLRP3抑制剂(MCC950)治疗卒中后，裂解的caspase-3的表达显着减弱，该治疗显著减少了脑组织梗死体积、神经元凋亡和神经损伤。

线粒体损伤是NLRP3炎性小体的另一个重要激活机制。线粒体是一个双膜结合的细胞器，是细胞内产生能量和ROS的主要部位[16]。以往的研究表明，在多种细胞应激下，尤其是线粒体产生的高水平的ROS激活了NLRP3炎性小体信号通路[17]。大量的ROS诱导ROS清除剂硫氧还蛋白从硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)中分解出来，然后直接与NLRP3蛋白结合，并通过寡聚作用调节其组装[18]。Ishrat 等[19]研究表明脑缺血发生后，脑组织中TXNIP表达增加，ROS能导致TXNIP和硫氧还蛋白1(thioredoxin,TRX1)解离后快速与NLRP3结合，诱导NLRP3炎性小体活化，抑制TXNIP使NLRP3炎性小体活化受阻，减轻缺血性脑损伤。功能障碍的线粒体还将线粒体DNA释放到细胞质中，通过分子自结合直接诱导NLRP3炎性小体复合物的组装[20]。

2.3 AIM2 AIM2炎性小体是一种细胞质传感器，可以识别来自病毒、细菌或宿主本身的双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)。AIM2由PYD和HIN-200结构域组成，AIM2蛋白是AIM2炎性小体激活成分。Li等[21]研究发现胞浆DNA通过环磷酸腺苷合成酶和AIM2参与多种独立但互补的DNA传感信号，在缺血时协同发挥最大的炎症反应。胞质双链DNA的抑制剂A151显著减少脑梗死体积，减轻神经缺陷，并减少细胞死亡，抑制整体神经炎性反应，并可能为缺血性卒中提供一种新的治疗理念。Liang等[22]发现MEG3基因敲除可抑制氧糖剥夺/复氧诱导的细胞焦亡和炎症反应。缺乏MEG3可抑制caspase-1信号转导，降低AIM2、ASC、裂解的caspase-1和GSDMD-N的表达，提示MEG3/miR-485/AIM2轴在脑缺血再灌注过程中通过激活caspase-1信号通路参与细胞焦亡的发生，可能是缺血性卒中有效的治疗靶点。

2.4 NLRC4 NLRC4又被称为IPAF(IL-1β converting enzyme protease activating factor，IL-1β转换酶蛋白激活因子)，为NLR家族成员之一。NLRC4受体的特征在于3个结构域：其N端为caspase募集结构域(caspase recruitment domain，CARD)，是效应结构域，可募集并活化Pro-caspase-1，负责下游信号转导；中间为NACHT结构域，是NLR家族成员共有的特征性结构域，自N端至C端依次为NBD-HD1-WHD-HD2，它能介导NLR分子的寡聚并改变其构型；C端为亮氨酸重复结构域(leucin rich repeat，LRRs)，负责PAMP等配体的识别和结合。近年来研究表明，炎性小体激活可导致神经元和神经胶质细胞死亡，进而导致缺血性脑卒中后脑部损伤和神经系统损害。Wang等[23]研究表明在高糖缺氧/复氧(H/R)诱导的小胶质细胞中，敲除长链非编码RNA-Fendrr(LncRNA-Fendrr)基因后，NLRC4和炎性细胞因子减少。LncRNA-Fendrr可通过E3泛素连接酶HERC2保护NLRC4蛋白的泛素化和降解，从而加速小胶质细胞的焦亡。

3 炎性小体参与脑缺血诱导的细胞损伤

3.1 炎性小体与细胞凋亡 细胞凋亡是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用。经典凋亡的激活主要通过两条途径发生。一种是外源性途径，通过激活细胞表面的凋亡受体激活，最终激活caspase-8或caspase-10；另一种是内源性途径，也称为线粒体凋亡途径，起始于线粒体细胞色素C并激活caspase-9。这两种途径都会导致信号转导级联反应，最终通过激活caspase-3导致细胞凋亡。以往的研究表明，脑缺血再灌注产生的自由基主要由线粒体释放，导致神经元的氧化应激。线粒体中活性氧的过量产生可损伤线粒体和脂质，从而损害线粒体功能并导致通透性增加。通透性增高的线粒体释放细胞色素C，激活caspase并导致脑缺血再灌注后的细胞死亡。Kang等[24]沉默TRIM22基因抑制NF-κB/NLRP3的激活，抑制神经炎症和细胞凋亡，表明TRIM22可能是治疗脑I/R损伤的潜在靶点。

3.2 炎性小体与细胞自噬 在自噬过程中，细胞内形成自噬囊泡，将自身的蛋白质或细胞器包裹，然后与溶酶体融合并对其降解。NLRP3炎性小体与自噬之间存在着密切关系。一方面，NLRP3炎性小体的激活可以调节自噬的诱导；另一方面，自噬可以控制炎性小体的激活及其活性。它们共同调节宿主防御、炎症反应及预防过度炎症间的平衡，并形成了必需的正负反馈循环。caspase-1的激活可抑制自噬诱导，激活炎症反应，这是清除病原体所必需的。然而，过度的炎症反应可以导致器官和组织损伤以及诱发炎性疾病。自噬可以通过清除NLRP3炎性小体激活物和炎性成分抑制炎症反应。Wang等[25]发现抑制GSK-3β可通过增强脑缺血再灌注损伤中的自噬活性而下调NLRP3表达水平，提示GSK-3β可能是其特异性靶点。He等[26]发现脑缺血再灌注损伤激活NLRP3炎性小体，提高caspase-1、IL-1β和IL-18水平，自噬活性增强。白藜芦醇是一种特异性NAD-依赖性去乙酰化酶Sirtuin-1(NAD-dependent deacetylase sirtuin-1，Sirt1)激动剂，白藜芦醇治疗明显减少了脑梗死体积和脑含水量，并改善神经学评分。侧脑室注射3-MA抑制自噬可阻断白藜芦醇对NLRP3炎性小体激活的抑制作用。敲低Sirt1显著阻断白藜芦醇诱导的自噬活性和对NLRP3炎性小体激活的抑制，上调自噬，提示白藜芦醇通过抑制Sirt1依赖的自噬活性来抑制NLRP3炎性小体的激活，从而对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

3.3 炎性小体与细胞焦亡 细胞焦亡是一种程序性细胞死亡，其发生途径主要为两条途径。caspase-1的经典细胞焦亡途径为NLR家族的pyrin结构域通过识别同源配体与ASC结合，而后结合并活化caspase-1的前体，形成具有活性的caspase-1。活化的caspase-1将GSDMD裂解为22 kDa的C端片段和31 kDa的N端片段，GSDMD-N的产生直接诱导了细胞膜穿孔、破裂，细胞内容物释放引发炎症反应。同时活化的IL-1β和IL-18蛋白通过细胞膜上的气孔被释放到细胞外[27]。在以革兰阴性菌表面内毒素(lipopolysaccharide，LPS)为代表的各种感染因素的刺激下，细胞焦亡非经典途径将被活化。caspase-11被证明能作为天然受体与LPS结合，LPS可以胞吞形式进入细胞与caspase-11前体结合并将其活化，活性的IL-1β和IL-18等内容物随着细胞膜的破裂、穿孔而释放引发炎症反应。同时，GSDMD的N端片段通过典型途径激活NLRP3，进而诱导细胞焦亡[28]。Li等[29]发现吲哚布芬或阿司匹林预处理联合氯吡格雷或替格瑞洛可通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路，减轻大鼠脑缺血再灌注和PC12细胞氧糖剥夺/复氧炎性小体介导的细胞焦亡。Fann等[13]的研究表明，脑缺血再灌注损伤发生时，外周炎性细胞透过血脑屏障与中枢系统活化的小胶质细胞均可释放等IL-18、IL-1β促炎性细胞因子，引起焦亡相关蛋白高表达，导致广泛的胶质细胞和神经元细胞死亡，表明细胞焦亡在脑缺血再灌注损伤过程中发挥重要作用，抑制NLRP3炎性小体表达可以同时抑制下游焦亡途径相关蛋白的表达，限制炎症反应并减轻脑缺血再灌注损伤，针对神经元炎性小体激活的治疗干预可能为未来缺血性卒中的治疗提供新的机会。

4 结语和展望

综上所述，缺血性脑卒中是一个多因素参与的病理生理过程，其发病机制较为复杂。对其病理生理学机制的深入研究将为该疾病的防治提供新的靶点。炎症反应作为一种组织损伤的先天免疫反应，在急性损伤性疾病如缺血性脑卒中发生时首先被激发，其过程中炎性小体发挥着重要的作用。目前为止，已发现二十余种炎性小体[30]，其在缺血性脑卒中发生后病变部位表达异常，表明炎性小体是缺血性脑卒中发生发展的重要组成部分。虽然很多研究者在动物实验研究上显示通过基因敲除及基因沉默等技术，能有效地调控炎性小体的活性，对缺血性脑卒中起到一定的神经保护作用，然而其研究仍需深入。因此，针对炎性小体信号上游和下游的多个潜在靶点的研究，如何通过干预炎症小体的表达、组装、活性及其产物来有效调控神经炎症、自噬、细胞凋亡等，并发现及挖掘有效的干预靶点，可能为该疾病的防治提供新的思路。