外泌体作为脑血管疾病治疗药物载体的研究进展

谢 姿， 马晓瑭， 张惠婷综述， 钟望涛审校

脑血管疾病是我国乃至全球最严重的疾病负担之一，具有高死亡率、高复发率和高致残率[1]。由于血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的阻碍，许多潜在治疗药物缺乏有效的递送方式，它们的临床应用受到限制。因此迫切需要开发新的治疗方法来克服BBB，提高疗效。众所周知，外泌体是一种由不同类型的细胞释放到细胞外基质的膜性小囊泡，广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，直径约为30 nm～150 nm，是细胞外囊泡的最小亚型[2]。它们在被释放的过程中携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类和核酸等生物大分子，是细胞间通讯的关键参与者[3]。自从发现外泌体在细胞间通讯的作用以来，以外泌体为载体的治疗药物研究不断发展[4,5]。与目前可用的人工药物递送载体相比，外泌体具有多种优势，首先，外泌体本身具有穿透BBB的能力，细胞靶向特性，其次，外泌体的循环稳定性可以避免巨噬细胞的吞噬作用，延长化学药物的半衰期[6]。因此，外泌体在给药过程中显著提高了某些可生物降解药物的给药效率，为脑内药物输送提供了天然纳米载体。本文概述了目前外泌体的载药方式和脑靶向途径，重点介绍了外泌体作为药物载体介导的miRNAs、蛋白质和化学药物递送在脑血管疾病中的治疗应用，并对目前外泌体载药仍然存在的问题和挑战进行了讨论。

1 外泌体载药方式

外泌体的脂质双层膜可作为天然屏障保护负载的药物，使其不会在血液中降解，极大地提高其治疗效果。但是，这种膜以及外泌体内源性成分的存在却阻碍了外源治疗药物的装载。因此，要将外泌体应用于靶向治疗，必须实现治疗药物的有效装载。在此，将概述几种不同的外泌体药物装载方法。

首先，最直接的方法是用需要负载的药物直接孵育供体细胞，然后收集和纯化用于疾病治疗的治疗性外泌体。这种方法主要用于小分子的负载。例如，MSCs和肿瘤细胞在与紫杉醇或甲氨蝶呤等化疗物质孵育时，能够将这些化疗药物包装在它们分泌的外泌体中[7]。对于基因治疗，病毒转导(慢病毒、腺病毒)是用miRNA和siRNA转染供体细胞的主要方法。通过使用这种预加载技术，MSC衍生的外泌体可将外源miRNA模拟物和pre-miRNA传递至人神经祖细胞(NPC)和星形胶质细胞[8]。尽管这种在外泌体生物发生过程中负载药物的方法实现了外泌体在体外的药物负载，但是由于外泌体内生物发生过程的复杂性，它的负载效率较低且不受控制。为了提高加载效率开发了一种新方法，即通过光学可逆的蛋白质-蛋白质相互作用(EXPLORs)进行蛋白质负载的外泌体。，Yim等人[9]通过将蓝光控制的可逆蛋白质-蛋白质相互作用模块与外泌体生物发生的内源性过程结合起来成功地将货物蛋白装载到新产生的外泌体中。

相比之下，将分离的外泌体与治疗性分子一起孵育来进行被动装载不仅更简单，而且受控且加载效率相对较高。例如，将外泌体与疏水性姜黄素一起孵育可将姜黄素有效地装载和递送到大脑中[10]。然而，简单的孵育仅能达到疏水剂可接受的负载效率。为了获得亲水性治疗剂的更高的装载效率，Alvarez-Erviti等人[11]通过电穿孔将siRNA加载到纯化的外泌体中，而外泌体的物理特性没有实质性改变。此外，皂苷透化、冻融循环、超声处理和挤压也已应用于外泌体药物的装载。Haney等人[12]比较了上述将抗氧化酶过氧化氢酶装载到单核细胞/巨噬细胞衍生的外泌体中的方法的装载效率，发现通过超声处理，挤压和皂苷透化可以达到更高的装载效率。这些主动的加载过程保持了外泌体的完整性，还保护了加载的过氧化氢酶免受循环降解的影响。将药物装载到外泌体的各种方法各有不同的装载能力，这取决于药物的特性，如亲水性、疏水性和分子量。除了考虑载药效率，外泌体膜的完整性和稳定性在药物传递中也很重要。如前所述，虽然通过超声和挤压将过氧化氢酶装载到外泌体中可以获得良好的酶活性，但也有研究发现膜完整性受损，膜结合蛋白结构可能发生改变，从而影响载药外泌体的治疗效果。因此，有必要进行进一步的研究。

2 外泌体脑靶向途径

外泌体具有基于供体细胞的天然靶向能力，不同类型的天然外泌体可以粘附不同的细胞。外泌体的这种天然靶向能力取决于外泌体的组成以及受体细胞的生理状态。外泌体表面配体与大脑内皮细胞受体之间的相互作用被认为是主要机制。例如，幼稚巨噬细胞外泌体可以通过外泌体上整合素淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)与细胞间粘附分子1(ICAM-1)和脑微血管内皮细胞上的碳水化合物结合性C型凝集素受体之间的相互作用穿过BBB[13]。除了穿越BBB的进入途径外，Grapp等人[14]还证明，外泌体也可以通过穿越脉络丛中的脑脊液-脑屏障进入大脑。他们发现，脉络丛上皮细胞产生的含叶酸受体-α(FRα)的外泌体可以穿过室管膜细胞层并分布到脑实质中，从而被星形胶质细胞和神经元摄取。这项研究提供了一种细胞特异性脑部药物递送途径。

此外，还可用脑靶向肽编码基因和外泌体蛋白质标记编码基因的融合基因转染祖细胞生成富含融合蛋白并具有穿越BBB能力的外泌体。例如，Alvarez等人[11]使用自衍生的树突状细胞来生产外泌体。通过对树突状细胞进行修饰以表达Lamp2b(一种外泌体膜蛋白)，该蛋白与狂犬病毒糖蛋白(RVG)肽融合，可以通过乙酰胆碱能受体靶向神经元来实现大脑靶向。鼻腔给药也是外泌体穿过BBB并到达中枢神经系统内的一种方式，鼻腔给药的药物主要通过嗅觉和三叉神经通路被转运到大脑[10]。尽管许多研究已经充分证明了鼻腔给药后外泌体脑传递的可能性[15]，但具体机制尚待阐明。

3 外泌体载药在脑血管疾病治疗中的应用

3.1 缺血性脑卒中 缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)是一种常见的脑血管疾病，是老年人群严重残疾和死亡的主要原因，占所有卒中的80%以上[16]。miRNAs是内源性的非编码小RNA分子，不仅可以作为卒中的诊断和预后的生物标志物，同时也具有显著的卒中治疗潜力。miRNAs在细胞间的转移被认为是外泌体发挥作用的关键物质[17]。例如，Hongqi Xin等人[18]发现MSC-外泌体可以将miR-133b转移至神经细胞促进IS后神经功能的恢复。诱导脑血管生成是改善IS损伤后功能恢复的关键。携带miR-181b的脂肪干细胞外泌体可以通过下调褪黑素7(TRPM7)水平促进体外缺氧损伤后脑微血管内皮细胞的血管生成[19]。炎症在IS的发病机制中起重要作用，抗炎是脑卒中治疗的重要靶点。Jiang等人[20]通过体内外研究发现负载miR-30d-5p的脂肪干细胞外泌体可以抑制自噬介导的小胶质细胞向M1极化，抑制炎症反应，减少梗死面积。环状RNA(Circ RNA)是一种分布广泛、细胞功能多样的内源性非编码RNA的新成员。研究显示外泌体负载Circ RNA SCMH1传递增强了IS模型的神经可塑性，抑制了胶质细胞的反应性和外周免疫细胞的浸润，促进了IS后的功能恢复[21,22]。

除了上述提到的RNA，外泌体还可以通过递送蛋白质、药物和激素等来参与IS治疗。如，来自血浆的外泌体可以递送热激蛋白70(HSP70)至脑缺血区域，抑制HSP70介导的活性氧生成，减少BBB破坏并防止线粒体损伤保护缺血再灌注损伤后的脑组织[23]。外泌体可以将药物依达拉奉输送到IS大鼠的缺血侧，并靶向神经元和小胶质细胞减少神经元死亡抑制神经炎症[24]。同样，运载褪黑素的外泌体也被证明对缺血诱导的炎症反应和炎症小体介导的细胞凋亡有很好的治疗作用[25]。

综上，外泌体通过装载某些特定内含物,如microRNA、Circ RNA、蛋白质等在神经、血管生成及炎症方面来影响IS的治疗和预后，很多干细胞来源的外泌体发挥了比干细胞本身更具优势的治疗作用，未来或许能为发挥干细胞治疗更大的潜力。但目前大部分研究还只在细胞和动物模型阶段进行，从临床试验层面来探讨外泌体承载的药物对IS的疗效研究亟待开展。

3.2 脑出血与蛛网膜下腔出血 脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是卒中最具破坏性的亚型，占所有卒中患者的10%～15%[26]。Zhang等人[27]发现装载miR-21的MSCs-外泌体可以为ICH的治疗提供一种新的方法，减轻ICH后继发性损伤引起的神经元死亡和脑血肿。富含miR-146a-5p的MSCs-外泌体可以减少脑出血后的神经元凋亡，抑制小胶质细胞M1极化，从而保护和改善损伤后的神经功能[28]。蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是ICH的一种常见类型，外泌体介导的miRNA递送也为SAH的治疗提供了新的方向。例如，在体内用miR-206-knockdown修饰的外泌体治疗后,通过靶向脑源性神经营养因子，可以治疗SAH后的神经功能缺损和脑水肿并抑制神经元凋亡[29]。Sun等人[30]发现miR-630高表达修饰的外泌体可以逆转SAH后内皮细胞屏障功能的异常。

3.3 脑动脉粥样硬化 脑动脉粥样硬化是脑血管疾病的主要原因。参与动脉粥样硬化的大多数细胞可以产生外泌体。因此，外泌体介导的miRNA或反义miRNA传递可被视为治疗脑动脉粥样硬化的工具。例如，miR-126、miR-145和miR-155都有希望用治疗脑动脉粥样硬化，miR-126过表达介导的内皮细胞外泌体具有抗动脉粥样硬化作用[31]，内皮细胞中过表达剪切反应转录因子Kruppel样因子2(KLF2)的外泌体通过输注ApoE-/-小鼠可减轻动脉粥样硬化斑块[32]。然而，使用外泌体进行脑动脉粥样硬化的治疗性输送仍处于初步阶段，要想发挥外泌体在脑动脉粥样硬化治疗上更大的潜力还需要更多的努力。

3.4 颅内动脉瘤 颅内动脉瘤(intracranial aneurysm,IA)的自发破裂是患者发病和死亡的主要原因。目前显微手术夹闭术及血管内介入栓塞术是预防IA的主要临床治疗手段。但是，对于具有高手术风险或无法手术的IA患者，则需要开发非手术创新疗法。第一个关于外泌体对IA破裂治疗效果的研究报道是由Liu等人[33]提出的，研究发现在IA的小鼠模型中静脉应用MSC-外泌体可将IA破裂率降低39%。在用外泌体处理的肥大细胞中也观察到前列腺素E2(PGE2)产生和其受体EP4表达的上调。而在小鼠中对外泌体施用选择性EP4拮抗剂可消除外泌体对IA破裂的治疗作用。这提示外泌体介导的特定种类的表面受体或蛋白质的转移可能是外泌体对IA治疗作用的潜在机制。

3.5 脑小血管病 脑小血管病(cerebral small vessel disease,CSVD)是一类广泛的脑血管疾病，主要影响具有多种不同病因的穿孔小动脉，毛细血管和小静脉。是老年人认知能力下降的主要原因[34]。CSVD的病理生理机制尚不清楚。关于外泌体在CSVD中的治疗应用也甚少，迄今为止，仅Josie C等人[35]报道在CSVD患者中发现循环外泌体中miR-17家族的多个miRNA的表达增加，但其在CSVD中的作用机制还不明确。因此，进一步阐明miR-17家族在CSVD的作用机制对CSVD的诊断和治疗十分重要，未来可能是通过外泌体药物递送治疗CSVD的新靶点。

4 总结与展望

综上所述，外泌体作为一种天然、新颖的药物递送载体，为药物进入中枢神经系统开辟了一条新途径。首先，外泌体的粒径很小，并且对于血脑屏障具有很高的渗透性。其次，外泌体是内源性物质，可以从患者体内分离出来，因此大大降低了毒性和免疫原性的风险。此外，来自特定细胞的外泌体包含天然治疗分子，这对于阐明发病机理和发现天然药物具有重要意义。但是，要将外泌体作为脑部药物递送载体应用于临床实践仍然存在许多需要解决的问题。首先，外泌体所递送药物的有效性和安全性，其获得的便捷性和经济性，以及体内使用的稳定性和安全性是解决问题的关键。此外，对于脑中外泌体是如何实现细胞间通讯以及如何进入大脑并将其货物运送到中枢神经系统的机制还不够清楚。阐明上述机制将对外泌体介导的脑部药物递送和脑血管疾病治疗产生重要影响。目前，解决上述问题以及如何发挥外泌体最大的临床潜力仍然需要多学科的共同努力。