PM2.5对皮肤角质形成细胞的影响

李锦濯 林志鹏 曾倩雯 孙仁山

陆军军医大学大坪医院皮肤科,重庆,400042

随着我国城市化及工业的快速发展，空气污染较严重。室外空气污染物的主要成分是颗粒物(particulate matter, PM)、臭氧、二氧化氮、二氧化硫和一氧化碳。其中颗粒物对健康的危害引起了广泛关注，根据颗粒物的空气动力学直径分为PM10、细颗粒物和超细颗粒物，细颗粒物是直径≤2.5 μm的颗粒物(PM2.5)，研究认为，颗粒物粒径越小，危害越大，PM2.5对人体健康的危害程度比较大颗粒物更严重[1]。

PM2.5主要来源为化学燃料的燃烧，生产生活排放的烟尘，各类交通工具的尾气以及自然扬尘等。PM2.5组成十分复杂，主要包括元素碳、多环芳烃等有机化合物、多种无机盐、重金属元素及混杂的生物物质等成分[2]。许多流行病学研究表明，环境PM2.5浓度增加与心血管系统和呼吸系统疾病的发病率及死亡率密切相关[3,4]。皮肤是抵御环境污染物的重要防御屏障，皮肤长期暴露在空气污染物中，PM2.5携带的有机化合物如多环芳烃(polynuclear aromatic hydrocarbon, PAH)等成分具有高度亲脂性，容易渗透进入皮肤[5]。经皮渗透性与屏障的完整性、解剖部位、年龄和污染物性质显著相关，这些被吸收的物质可引起皮肤损伤。越来越多的证据表明PM2.5与特应性皮炎、痤疮、湿疹、银屑病等炎症性皮肤病以及皮肤老化等多种皮肤病具有相关性[6]。目前研究认为，空气污染导致皮肤损伤的可能机制有四种：(1)活性氧自由基的生成;(2)炎症级联反应的诱导;(3)皮肤屏障的损伤;(4)芳烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AHR)的激活[7]。角质形成细胞是皮肤表皮层的主要细胞，与外界刺激物直接接触。角质形成细胞是PM2.5作用于皮肤的主要靶细胞之一，当人体长时间暴露在 PM2.5的环境下，角质形成细胞受到损伤，可能增加多种皮肤病的发病率。为探讨 PM2.5对皮肤角质形成细胞的生物学效应，本文综述了PM2.5与皮肤病的关系以及PM2.5对皮肤角质形成细胞增殖活性、细胞凋亡、细胞自噬、芳香烃受体激活、氧化应激以及炎性反应等方面的影响。

1 PM2.5与皮肤病的流行病学研究

流行病学研究报道PM2.5可以增加特应性皮炎、痤疮、湿疹、皮肤肿瘤等皮肤病以及皮肤老化发生的风险。Kim等[8]基于广义线性混合模型的研究表明，随着PM2.5和PM10暴露量的增加，特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)症状显著加重。

Le等[9]Meta分析结果表明，PM与AD、湿疹和皮肤过敏密切相关，PM10和PM2.5与AD的风险增加均有关，但PM2.5体积较小，含有重金属成分较多，容易渗透到皮肤细胞，更容易引发AD，因此与PM10相比，PM2.5和空气颗粒物污染相关皮肤病之间的关系更密切，具有更高的风险。研究发现暴露于空气污染物可以加重寻常痤疮的症状[10]。研究认为部分青春期后痤疮与环境污染相关，如氯痤疮与接触二噁英或其他氯化烃类污染物密切相关[11]。有研究对北京市大气污染与门诊寻常痤疮患者数量进行相关性分析，发现环境PM2.5浓度与寻常痤疮患者就诊数量显著相关，为寻常痤疮与空气污染之间的关系提供了间接证据[12]。研究表明，暴露于PM2.5可加重儿童过敏性皮炎和湿疹的症状[13]。研究表明，空气污染成分，特别是PM、PAH和臭氧，可以导致皮肤过早老化，皱纹的出现[14]。Peng等[15]研究纳入400名年龄在40～90岁的女性，分析PM2.5浓度高低对皮肤老化的影响，发现PM2.5浓度较高地区与PM2.5浓度较低地区的人群相比，面颊部和手背部的老年色斑数量分别高出1.48倍和2.8倍，高浓度PM2.5暴露与皮肤老化显著相关。此外，研究显示PM是皮肤肿瘤尤其是黑色素瘤的高危因素[16]。然而，目前关于PM2.5对皮肤损伤的具体机制研究仍然有限，国内外学者多选用人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞株)作为体外实验研究对象来研究 PM2.5 对皮肤损伤的相关机制。

2 PM2.5对角质形成细胞的影响

2.1 PM2.5对角质形成细胞增殖、自噬、凋亡的影响 研究表明，多环芳烃类为主的有机物、各种重金属元素及病原微生物可能是PM2.5主要毒性成分，可降低细胞存活率并对细胞自噬、凋亡等产生影响。薛晨红等[17]采集北京市雾霾天气PM2.5刺激HaCaT细胞，发现随着PM2.5浓度升高，200～800 mg/L组HaCaT细胞形态发生改变，漂浮死亡细胞逐渐增多；与对照组相比，100～400 mg/L组细胞存活率降低，凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明PM2.5可抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡，其机制可能是通过下调细胞周期蛋白A2(cyclin A2)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinases1, CDK1)蛋白的表达来诱导S期阻滞。盛晚香等[18]研究发现经PM2.5染毒后HaCaT细胞内自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain3, LC3)表达高于对照组，且呈浓度依赖性升高，表明PM2.5诱导角质形成细胞发生自噬，可能是细胞对抗氧化应激损伤及细胞凋亡的一种自我保护反应。Hu等[19]研究表明，随着PM2.5刺激浓度增高，HaCaT细胞存活率降低，同时伴随着细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的释放显著增加，表明细胞膜完整性的丧失和通透性的增加，同时发现PM2.5导致细胞内DNA损伤并诱导细胞凋亡，细胞内细胞色素C、半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)及半胱氨酸蛋白酶9(caspase9)表达呈剂量依赖性增加，提示PM2.5通过线粒体途径诱导细胞凋亡。

2.2 PM2.5对角质形成细胞内芳香烃受体激活的影响 研究表明PM2.5中携带的多种有机化合物(多环芳烃等)可以激活细胞内AHR[20]。AHR是一种配体激活的转录因子，作为外界环境刺激的传感器，参与皮肤病理生理过程，皮肤细胞内AHR激活可能与皮肤色素沉着、皮肤肿瘤、炎症性皮肤病等皮肤损害的发生发展密切相关[21]。Jang等[22]发现PM可以导致HaCaT细胞中AHR信号激活，LC3蛋白表达增多，而使用AHR抑制剂可以显著降低LC3蛋白水平，表明PM通过AHR信号诱导HaCaT细胞自噬。Tauchi等[23]研究表明皮肤细胞内AHR通路激活会引起炎症性皮肤损伤。Hidaka等[24]研究发现空气污染物诱导角质形成细胞中AHR的激活和神经营养因子Artemin (ARTN)的过表达，导致特应性皮炎相关炎症因子TSLP和IL-33表达上调，表明AHR激活可能是空气污染引起特应性皮炎加重的机制之一。

PM2.5诱导HaCaT细胞内AHR激活可能是其引起皮肤老化的机制之一。Ryu等[25]研究表明PM2.5引起皮肤衰老的可能机制是PM2.5诱导角质形成细胞内AHR激活，导致活性氧(ROS)生成增多，进而导致衰老相关基因表达的表观遗传修饰。Qiao等[26]研究显示PM2.5激活角质形成细胞内AHR，AHR通过调控丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路中的ERK/MAPKs和JNK/SPAK信号通路介导皮肤老化相关基因基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1, MMP1)的表达。

PM2.5诱导HaCaT细胞内AHR激活，进而可以导致下游ROS生成增多，炎症信号激活，皮肤屏障蛋白表达异常。Choi等[27]研究表明沙尘暴中粉尘颗粒物可以诱导角质形成细胞内AHR激活，使细胞色素p450酶如：CYP1A1、CYP1A2 和 CYP1B1 的基因转录增强，导致ROS和下游炎症因子产生增多，同时影响表皮分化蛋白的异常表达，产生皮肤损伤效应。Lee等[28]研究表明PM2.5通过激活HaCaT细胞内AHR，引起ROS的生成增加，进而激活两条MAPK信号通路：一条通过ERK/p38激活核转录因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)，另一条通过JNK激活转录因子激活蛋白1(activator protein-1, AP-1)，最终导致环氧合酶2(cyclo-oxygenase-2, COX2)和前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)表达增加，而丝聚蛋白表达下调，引起皮肤屏障受损。

2.3 PM2.5对角质形成细胞氧化应激的影响 氧化应激是细胞受到外界有害因素刺激后最早出现的指标，氧化应激是由活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的过量产生或清除不足引起的。研究认为，PM2.5诱导氧化应激是其损伤效应的一个重要机制，过多的ROS生成会导致DNA损伤和细胞内信号传导异常，导致免疫系统失调，并诱发加重炎症性皮肤病、皮肤老化和皮肤肿瘤等多种皮肤疾病[29]。PM2.5可以通过多种途径导致过量的ROS产生，PM2.5表面结合的多环芳烃和醌类化合物表现出强烈的氧化还原活性[30]，可以通过氧化还原反应形成ROS。PM2.5中的金属如铁、铜等可以通过芬顿反应产生ROS[31]。在细胞内，PM2.5可以通过改变NAPDH氧化酶和线粒体功能诱导内源性ROS水平升高[32]，此外，如上所述，PM2.5还可以通过诱导HaCaT细胞内AHR激活，进而导致ROS产生增多。

一方面，PM2.5诱导细胞生成过量的ROS，可以损害DNA、脂质和蛋白质等生物大分子以及细胞器进而导致靶细胞损伤。Piao等[33]研究显示PM2.5通过产生ROS引起氧化应激，导致DNA损伤、脂质过氧化和蛋白质羰基化，引起内质网应激、线粒体损伤和细胞自噬，并最终导致HaCaT细胞凋亡，而抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine, NAC)可减轻PM2.5诱导的细胞损伤，证实PM2.5产生的细胞毒性是氧化应激所致。Lin等[34]研究表明PM2.5可诱导HaCaT细胞氧化应激，破坏皮肤完整性。另一方面，PM2.5不仅刺激ROS生成增加，同时还损害细胞内抗氧化反应体系，如抑制细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等抗氧化酶活性，降低细胞清除ROS的能力，从而使细胞处于氧化应激状态。熊书晗等[35]研究发现PM2.5刺激HaCaT细胞后丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量、ROS水平显著高于对照组，而SOD和GSH-px的活性显著下降，表明PM2.5能够对HaCaT细胞造成氧化应激损伤。

2.4 PM2.5对角质形成细胞炎症反应的影响 角质形成细胞作为表皮层主要的构成细胞，通过其模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)转导信号，介导一系列免疫炎症反应，在皮肤天然免疫反应中发挥重要作用。在外界环境因素刺激下，通过产生抗菌多肽， IL-1、IL-8、IL-18、IL-6、TNF-α等细胞因子以及CCL20、CXCL9、CXCL10、CXCL11等趋化因子，进而激活或募集其他皮肤免疫细胞如树突状细胞、T细胞、中性粒细胞等，发挥免疫保护作用[36]。PM2.5含有PAH、重金属、内毒素等组分，能诱导细胞产生大量炎性介质如：IL-1β、IL-8、IL-6、TNF-α等，这些炎性介质通过复杂的免疫途径引起免疫损伤[37]，可能在皮肤炎症性疾病的发病机制中发挥作用。Kim等[38]使用转录组和基因本体富集分析的新一代测序方法研究PM2.5对角质形成细胞的影响，发现炎症因子如TNF、IL-1α等以及银屑病相关炎症因子如IL-17A、IL-36γ等基因表达显著改变，同时PM2.5导致细胞内p38 MAPK信号通路及NF-κB信号通路磷酸化激活。

PM2.5对角质形成细胞炎症反应的影响涉及多个细胞表面受体，多条细胞内炎症信号通路。Ryu等[39]研究发现PM2.5通过TLR5-NOX4-ROS-NF-κB-IL-6通路诱导角质形成细胞炎症反应，靶向阻断细胞表面的TLR5-NOX4可能是减轻PM2.5炎症损伤的一种治疗策略，此外，PM2.5诱导的IL-6转录升高是通过表观遗传修饰的DNA甲基化和组蛋白甲基化来调控的。Kwon等[40]研究表明城市颗粒物可以通过NF-κB和p38 MAPK信号通路激活增加角质形成细胞表面的辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid-1,TRPV1)表达上调，从而增加Ca2+内流水平和促炎细胞因子IL-8、TNF-α和IL-1β的表达，最终导致皮肤损伤。Zhang等[41]通过构建细胞培养芯片和蛋白质芯片相结合的微流控系统，研究PM2.5暴露对HaCaT细胞的影响，结果发现PM2.5诱导HaCaT细胞中NF-κB和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)炎症体信号激活， IL-1β和IL-6表达上调。刘丹等[42]测定雾霾和沙尘暴两种不同天气下收集的PM2.5对HaCaT细胞分泌炎症因子的影响，结果发现沙尘暴天气PM2.5具有更强的促炎症效应，而雾霾天气PM2.5具有更强的致敏反应，而其致敏反应可能是通过TLR2/4等促免疫信号通路。

目前研究认为，PM2.5导致的炎症反应主要是由氧化应激介导的。Kim等[43]研究表明PM2.5颗粒的表面反应活性可以直接产生ROS，也可以通过细胞内线粒体损伤途径及氧化还原途径诱导ROS的生成，而ROS可以激活下游MAPK信号通路，包括ERK1/2、JNK和p38，随后激活NF-κB和AP-1等转录因子，最终导致细胞因子TNF-α、IL-1α、Il-6等表达上调。

2.5 PM2.5对角质形成细胞内皮肤屏障相关成分表达的影响 角质形成细胞中表达与皮肤屏障功能相关的成分包括丝聚蛋白、角蛋白、紧密连接蛋白及脂质成分等，这些成分的表达异常将导致皮肤屏障受损。PM2.5可能通过影响角质形成细胞内皮肤屏障相关蛋白、脂质的表达进而破坏皮肤屏障功能。Nguyen等[44]发现，HaCaT细胞暴露于PM后角蛋白16的表达下调，角蛋白16是表皮细胞增殖的标志，负责角质形成细胞的机械完整性，其表达异常可导致皮肤屏障受损。Kim等[38]通过分析PM2.5对角质形成细胞转录组的影响，发现PM2.5可诱导细胞皮肤屏障相关蛋白表达的异常，主要表现为丝聚蛋白、内披蛋白、转谷氨酰胺酶3等表达升高及角蛋白10和15表达降低，导致皮肤屏障受损。姚骐羽等[45]发现PM2.5导致角质形成细胞内角蛋白14、丝聚蛋白和紧密连接蛋白1的表达改变，同时诱导炎症因子IL-1α、TSLP、IL-33表达上调，在炎症因子的协同作用下加剧皮肤屏障损伤。Liao等[46]通过对PM2.5染毒的角质形成细胞进行转录组分析，发现PM2.5影响胆固醇代谢相关基因表达改变，在PM2.5暴露的3D皮肤模型中，发现胆固醇升高，角鲨烯降低，而胆固醇和角鲨烯是影响皮肤屏障功能的关键物质，表明PM2.5可能通过影响角质形成细胞胆固醇的合成改变导致皮肤屏障受损。

2.6 PM2.5与紫外线共同作用对角质形成细胞的影响 室外空气中PM2.5污染可以与紫外线共同作用损伤皮肤，因此，部分研究把PM2.5与紫外线联系起来综合考虑两者对皮肤的生物学效应，目前已有实验将PM2.5成分与UVB或者UVA联合刺激角质形成细胞进行研究。Hyun等[47]研究发现，与单纯的PM2.5或UVB处理相比，PM2.5和UVB的联合处理HaCaT细胞产生更多的ROS，导致细胞内脂质过氧化、DNA氧化损伤及细胞凋亡程度更严重。牛梦鸽等[48]研究表明PM2.5和UVB联合处理HaCaT细胞后细胞活力显著低于单纯的PM2.5组及UVB组，说明PM2.5与UVB联合处理对抑制细胞活力有协同作用，且联合处理后细胞自噬标志蛋白LC3-II表达高于单纯的PM2.5组及UVB组，说明联合作用后PM2.5诱导较强的自噬增加了UVB对HaCaT细胞的损伤。此外，研究认为PM2.5中的有机成分PAH对光敏感，可吸收UVA范围内的光照，PHA在UVA暴露下会产生ROS，两者协同作用损伤皮肤[49]。Soeur等[50]采用纳摩尔浓度的PAH来模拟PM通过吸入后的循环途径对皮肤的影响，发现PAH在低浓度下显示出较高的光敏性，UVA1 联合PAH处理角质形成细胞后，表现出显著的协同损伤作用，与单纯处理组相比，联合处理组更加显著的抑制了细胞增殖，增加了ROS的生成，同时观察到细胞内线粒体膜去极化和ATP产生减少。

3 小结

综上所述，流行病学研究显示PM2.5与多种炎症性皮肤病、皮肤肿瘤以及皮肤老化具有相关性。基础实验研究表明，PM2.5可引起角质形成细胞增殖活性降低，诱导细胞自噬及细胞凋亡，同时诱导细胞内AHR激活，氧化应激状态，炎症级联反应以及皮肤屏障相关成分表达改变，此外PM2.5与紫外线对角质形成细胞可能具有协同损伤作用。目前多数研究认为PM2.5对角质形成细胞的影响机制主要以氧化应激和炎症损伤为主。PM 2.5对角质形成细胞的影响并不是单一途径，而是多种途径，多种机制参与的复杂过程，不同机制间存在相互联系，相互影响，各机制之间具体是如何相互作用的目前还不是很明确。

此外，尽管不同地区的PM2.5化学组分类似，但其中各化学组分占比差异很大。主要原因是各地区排放源的不同，例如城区车辆尾气排放、北方冬季燃料供暖、石油化工聚集区排放、工业聚集区排放及建筑区的扬尘等都会影响该区域PM2.5组成变化。最终导致不同的采样地点和采集时间等收集的PM2.5具有成分差异，其对细胞的损伤作用及相关机制也可能不同。因此，研究PM2.5中具体哪些化学组分诱导氧化损伤及炎症损伤对于机制研究具有重要意义。总之，PM2.5究竟是通过何种机制损伤角质形成细胞，进而导致皮肤相关疾病发病率增高或症状加重以及如何进行有效防治，还有待进一步研究。