Wnt/β-catenin信号通路调控听觉系统的研究进展

许应鹏 孙晨 李琦

南京市儿童医院耳鼻咽喉科(南京210008)

WHO统计数据显示全球超过5%的人口，约4.66亿人有听力损失，到2050年，将有超过9亿人患有听力损失性疾病，如何改善听力损失成为亟待解决的问题。Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号通路的经典途径，通过β-catenin,TCF两个关键调节因子，从转录水平上影响相关的靶基因的表达来调控机体的生长发育，广泛的参与各种疾病，包括退行性疾病，代谢性疾病和癌症的发生，发展，与听觉系统疾病也有着密切的关系，是解决听觉疾病的新靶点。本文总结了Wnt/β-catenin信号通路调控听觉系统的最新研究进展，为听力疾病的分子生物学机制研究与临床治疗提供理论基础。

1 Wnt/β-catenin信号通路

当Wnt信号存在时，Wnt蛋白与细胞膜上卷曲蛋白受体（Frizzled receptor，Fz）结合，引起脂蛋白受体相关蛋白5/6（LDL-receptor-relatedprotein 5/6，LRP5/6）磷酸化和Fz-LRP5/6复合物的形成，磷酸化的LRP5/6与Axin蛋白亲和，Axin上结合的糖原合酶激酶 3（Glycogen synthase kinase 3，GSK3），络氨酸激酶1（Casein kinase 1，CK1）磷酸化LRP5/6,进一步促进LRP5/6与Axin的结合。通过DEP和PDZ结构域，蓬乱蛋白（Dishevelle，Dvl）与Fz结合，Dvl和Axin拥有相同的DIX结构域，形成的多聚体能够促进Wnt-Fz-LRP5/6复合物的形成，β-catenin降解复合物的解体[2]。另一方面，Wnt与Fz结合，激活细胞膜内侧的CK1，激活的CK1磷酸化Dvl，释放GSK3β 结合蛋白（GSK3β binding protein，GBP），GBP能够识别并结合GSK3β，抑制GSK3β磷酸激酶活性，阻止β-catenin阶梯磷酸化。因此，当Wnt信号存在时，Wnt受体复合物的形成促进降解复合物的解体，导致β-catenin的积聚。

β-catenin在胞质中积聚，在多种酶的共同作用被转运到细胞核内，进入细胞核内的β-catenin通过直接结合一个低亲和力的N端重合位点替代Groucho/TLE等抑制性因子与Tcf/Lef结合，激活转录复合物。

2 Wnt/β-catenin信号通路通调控听力疾病机制

2.1 Wnt/β-catenin信号通路调控听力系统发育

Wnt信号是胚胎发育的标志，在胚胎发育的不同阶段承担着不同的作用，在听力系统中参与耳的结构特异性发生，前庭结构的形成和耳蜗的发育。在胚胎发育的神经发生期，外胚层在周围信号的影响下异化成耳基板，耳基板内陷融合形成充满液体的听囊，神经母细胞从囊泡中分离到外胚层附近，最终成为前庭和耳蜗（螺旋）颅神经节。同时，囊泡的单纯上皮通过定向生长，上皮融合和程序性细胞死亡的局灶性热点被雕刻成一组腔室和导管[3]。邻近的间充质组织包绕上皮形成封闭的液腔，这些腔室和神经节被软骨膜包绕保护，软骨膜最终骨化形成内耳结构[4]。

早期胚胎发育过程中，Wnt对前后体轴的形成非常重要，能够同时抑制胚胎前化，促进胚胎后化。来自相邻后脑的高Wnt信号能够促进耳廓上裂（otic-epibranchial placode，OEP）向耳的分化，低Wnt和高成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGF）信号将这种分化限制在OEP的外侧[5]。当耳基板内陷形成耳蜗囊泡时，Wnt和Shh信号通过调控靶基因Dlx5/6，Hmx2/3和Gbx2在大鼠背腹轴的建立上发挥着重要作用，,这些基因促进了前庭系统内淋巴管和半规管的形成[6]。

Wnt在胚胎耳蜗发育作用在三个潜在的窗口期：在小鼠胚胎日（embryonic day，E）12.5Wnt激活促进祖细胞增殖；在E13.5Wnt信号通路通过调控Fgf20信号通路促进退出细胞周期的前感觉细胞中Sox2的表达；Wnt信号通路的激活还促进了耳蜗毛细胞的形成，并且在胚胎发育和新生早期重新编程支持细胞重新进入细胞周期，分化为毛细胞。

在E12.5，祖细胞仍在进行增殖，通过LiCl激活Wnt通路在体外实验中能够极大的扩展Sox2的增殖域[4]。成年小鼠海马区的研究揭示了Notch结构域能够结合sox 2启动子上的rbpj结合位点，提示Notch可以直接激活sox 2转录。Wnt能够在癌细胞中增强Notch信号[7]，类似的在早期发育过程中，Wnt还通过上调Notch通路中Jagged 1的表达，在耳基板的形成过程中增强Notch信号[8]，这些研究表明，Wnt确实可以提高Notch早期的作用，增强Sox 2的表达，促进祖细胞增殖，但我们也不排除Wnt可能对Sox 2的调控有更直接的影响，这需要等待进一步的发现。

发育中的耳蜗在E13.5进入终末有丝分裂期，Sox2水平的小幅升高能够触发小鼠胚胎干细胞的分化，但Sox2的过表达和wnt/β-catenin的强制激活阻止了前感觉细胞的完全分化。前感觉细胞向毛细胞的分化呈现明显的Sox2浓度依赖性，通过与atoh1增强子区的结合，Sox 2直接激活atoh 1，在体外[9]和体内[10]诱导异位听觉毛细胞的产生。随后Sox2表达的减少对于毛细胞成熟是必要的，因为高水平的Sox2会激活Atoh 1的抑制子，维持支持细胞的命运[11]。Sox 2是毛细胞增殖分化所必需的，高浓度的Sox2又抑制了毛细胞的分化，因此它与毛细胞形成的关系被认为是一种“非相干前馈回路”[12]。Wnt可能与Notch一起参与促进FGF 20介导的Sox 2浓度在有丝分裂后耳蜗内的升高抑制分化。Wnt活化促进了早期神经前体细胞基因的表达，虽然尚不清楚这是通过Sox 2发生的，还是独立发生的，但有一些初步证据表明，β-catenin通过与前感觉细胞中的3’增强子区域相互作用而上调了Atoh 1[6]。由此可见，Wnt能够通过Notch、FGF20等不同途径，间接或直接的参与到不同阶段细胞命运的抉择。

2.2 Wnt/β-catenin信号通路对听觉细胞的保护作用

2.2.1 Wnt/β-catenin信号与遗传性耳聋

听力损失是人类最常见的神经感觉障碍之一，超过50%的听力损失是遗传性耳聋造成的，以常染色体隐性遗传为主的遗传性耳聋占遗传性耳聋75%-80%，超过60个基因与常染色体隐性耳聋相关[13]。70%的遗传性耳聋是非综合征性耳聋（nonsyndromic hearing loss，NSHL），表现为孤立性的听力损失，不伴随其他相关临床症状。

哺乳动物内耳发育期间，Wnt/β-catenin信号通路诱导囊泡发生，指导前庭器官的形成，在耳蜗毛细胞发育中也起着重要作用。低脊椎动物的研究显示，Wnt信号通路与支持细胞的增殖、毛细胞维持和再生有关，脂蛋白受体相关蛋白5（LDL-receptor-relatedprotein 5，LRP5）缺乏对Wnt信号通路的抑制可能导致听力损失[14]。通过对一个中国非综合征感音神经性耳聋家系进行全外显子组测序（whole exome sequencing，WES），寻找在Wnt信号通路中起重要作用的致病基因LRP5。LRP5基因由22个内含子和23个外显子组成，位于11q13染色体上。LRP5蛋白是调控Wnt信号通路的膜结合的Wnt受体，通过四个重复的β螺旋/表皮生长因子（β-propeller/epidermal growth factor，EGF)重复序列结构域与Wnt配体结合[1]。在NSHL家系发现的LRP5的纯合错义突变下调β-catenin和Lef-1的表达，抑制下游增殖基因的表达。LRP5基因敲除直接影响Wnt信号通路相关基因的表达，导致毛细胞和支持细胞增殖减少，毛细胞和支持细胞数量减少，最终导致听力下降[16]。LRP 5突变通过Wnt信号通路导致听力损失的发现能够帮助科学家更多地了解耳聋的发病机制，并找到更多的预防和治疗耳聋的方法。

2.2.2 Wnt/β-catenin信号通路与年龄相关性聋

衰老是一种自然现象，伴随着生理功能的逐渐退化和疾病的易感性增加。年龄相关性听力损失（age-related hearing loss,AHL）是由衰老引起的普遍的感觉神经性听力障碍，以听声音和理解语音的能力降低，对声音信息的中央处理能力降低以及定位声源的能力降低为主要症状[17]。中心听觉系统的年龄相关退化会影响语音理解和声源定位，越来越多的证据表明，随着年龄的增长，中枢听觉系统的退化在老年性耳聋的发病过程中起着关键作用[18]。

研究发现Wnt/β-catenin通路参与某些衰老相关疾病，例如β-catenin的表达减少与年龄相关的骨质疏松症有关[19]，功能失调的Wnt信号转导也与阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease，AD）的发生有关：降低β-catenin的表达提高了AD祖细胞中神经损害的发生，而高表达的β-catenin能够通过降低β-淀粉样蛋白的毒性提供神经元保护[20]。动物研究表明，伴随着Wnt/β-catenin信号通路的表达降低，D-gal模型鼠和老年大鼠在听觉皮质中表现出更多的神经元凋亡和神经变性。可见Wnt/βcatenin信号的异常调控会使听觉皮层神经元对凋亡敏感，进而导致神经变性。有趣的是，通过长期的Licl治疗诱导的Wnt/b-catenin信号通路的激活逆转了D-gal诱导的神经退行性变，这些可能是通过调节B淋巴瘤Mo-MLV插入区1（B lymphoma Mo-MLV insertion region 1，BMI1）的表达而发生的[21]。典型的Wnt信号参与了听觉器官的发育和听觉系统功能的维持，这些发现为Wnt/β-catenin信号通路对老年性听皮层变性的保护作用提供了新的证据，为老年性耳聋的治疗提供了潜在的方向。

2.2.3 Wnt/β-catenn信号通路与药物性聋

哺乳动物的听觉细胞有许多线粒体，呈现高耗氧量特点，这使得它们对氧化应激非常敏感，特别是当受到噪音或耳毒性药物的刺激时，细胞内ROS积聚，线粒体释放细胞色素能够很快引起细胞凋亡[22]；一些药物如顺铂还会形成水性复合物聚积导致DNA损伤和交叉结合，激活caspase3诱导的凋亡；促炎症因子TNF-α,IL-β，IL-6和NF-kb的释放也会导致促凋亡因子的激活[23]。如何减少耳毒性药物对听力的影响是当前研究的一个方向。

Wnt通路的促存活活性在许多组织中报道，并被认为是通过诱导特异性抗凋亡基因介导的。例如，在视网膜神经节细胞中Wnt激活通过增加包括NT3、BDNF和NGF在内的保护性生长因子的表达来减少细胞凋亡[24]。在耳蜗细胞中，Wnt通路也发挥着类似的作用，通过GSK3β抑制剂预处理的HEI-OC1耳蜗毛细胞系在经过新霉素[25]、顺铂[26]处理过后较对照组细胞凋亡明显减少。研究发现，新霉素、顺铂等耳毒性药物造成了HEI-OC1毛细胞中β-catenin磷酸化的增加，Wnt通路激活后抑制了顺铂诱导的P53的磷酸化，降低了炎性因子NF-kb,TNF-α,IL-6的表达，积聚的β-catenin有可能直接参与了NF-kb的调控，但具体机制仍待进一步研究，但毫无疑问的是激活的Wnt通路能够保护毛细胞，降低药物的耳毒性。

2.3 Wnt/β-catenin信号通路调控听觉细胞再生

感音神经性耳聋常由于过度刺激、耳毒性药物、感染、自身免疫性疾病或老化引起的耳蜗毛细胞退化引起[27]。非哺乳动物斑马鱼和鸡中，活跃的Wnt信号通路可以促进受损的耳蜗毛细胞增殖和再生，而哺乳动物中这种损害往往是不可逆的，丢失的听觉毛细胞在哺乳动物中不能自发地被替换，再生可能受限于Lgr5（leucine-rich repeat-containing G protein coupled receptor 5）和Axin2阳性的祖细胞[28]，但内耳干细胞、基因治疗和信号转导基因工程等技术的发展为听觉细胞的再生研究提供了条件。

Lgr5是wnt信号通路的下游靶基因，在多种组织中标记成体干细胞，广泛存在于胚胎和新生小鼠耳蜗[5]。Lgr5+细胞具有自我更新，增殖和再生耳蜗毛细胞的能力，在体内外实验中，均能够作为耳蜗毛细胞的祖细胞。在毛细胞损伤的情况下，激活Wnt通路，增加Lgr5的表达，能够诱导Lgr5+的內柱细胞和第三排Deiters细胞增殖并分化为新生的耳蜗内毛细胞，但在未损伤的成人耳蜗中，这种诱导并没有发生[2]。与Lgr5类似，Axin2也是wnt通路的下游靶基因，主要在哺乳动物耳蜗鼓室边缘细胞中表达[3]。新生儿耳蜗中，位于感觉上皮下方的Axin2+鼓室边界细胞在体外具有增殖和再生潜力，在wnt激活剂存在的情况下，这些细胞迅速进入增殖状态，分化为毛细胞和支持细胞[30]。因此，活化的Wnt信号影响新生耳蜗中Lgr5+祖细胞和Axin2+耳蜗鼓室边缘细胞的增殖和再生。

Atoh1，一种基本的螺旋环螺旋转录因子，在上皮细胞和神经细胞类型的分化中起着至关重要的作用，是毛细胞发育的关键调节因子。Atoh1敲除的小鼠缺乏许多肠道上皮细胞类型，小脑和脊髓神经元发育不完全，内耳毛细胞完全缺乏[31]。Atoh1对于在毛细胞受损母体内产生新生毛细胞是必须且充足的，过表达的Atoh1诱导非感觉细胞分化为毛细胞，新生的内毛细胞形态正常，能够发挥功能，明显改善母体听力阈[26]。Wnt通路可以提高Atoh1的表达，通过与Atoh1的3’增强子内的Tcf-Lef位点相互作用，促进Atoh1的转录，Notch信号调节Atoh1表达的作用也依赖于β-catenin的作用[31]。Atoh1在耳蜗内诱导非感觉细胞分化为新生毛细胞的能力使得Atoh1恢复毛细胞的作用机制和临床应用成为当前研究的热点。

3 结语

Wnt/β-catenin信号通路在听力系统发育的各个阶段发挥着不可代替的作用，在胚胎发育阶段Wnt/β-catenin信号通路能够促进听觉器官的形成、祖细胞的增殖、毛细胞的增殖和分化，异常表达常见于以非综合征性耳聋为主的常染色体遗传性耳聋。Wnt/β-catenin信号通路维持着听觉系统的正常运作，能够保护听觉细胞，提高听觉细胞的抗氧化能力，进一步的，Wnt/β-catenin信号通路能够通过降低积聚在神经细胞的β-淀粉样蛋白的毒性来提供神经元保护。得益于非哺乳动物中发现的Wnt/β-catenin通路对听觉细胞干细胞特性的激活作用，对于难以逆转的毛细胞损伤的恢复也不再是难以触及。Wnt/β-catenin信号通路为治疗相关耳聋性疾病提供多个作用位点，使听力损失的治疗方法有了长足的发展并获得阶段性的成果，而如何让治疗走向临床是我们下一步需要思考的问题。