高强度丝蛋白/聚乙二醇冻凝胶的制备和表征

2020-12-31唱焕良邵长优

功能高分子学报 2020年1期

唱焕良，邵长优，孟蕾，杨俊

（北京林业大学材料科学与技术学院，林木生物质化学北京市重点实验室，北京 100083）

冻凝胶是一种新型凝胶材料，其形成过程是通过聚合物前体溶液在低温条件下通过形成冰晶来提高未冷冻部分溶液的浓度，利用高浓度的凝胶化反应制备出高固含量和高强度的凝胶网络结构。这种方法制备的冻凝胶通常具有分布均匀、相互连通的孔状结构，这为细胞附着、渗透、增殖和变异提供了适宜的条件[1]，因此在组织工程领域备受关注。丝蛋白（SF）是一种无生理活性的天然高分子材料，具有来源丰富、价格低廉、生物相容性好且可降解等优点[2]。Santin 等[3]研究表明SF 具有较低的炎症反应；吴海涛等[4]证明SF 对软骨细胞具有良好的黏附增殖作用，这表明SF 在组织工程领域有着广阔的应用前景；段郁等[5]通过丁醇诱导和冷冻融化法制备了柞蚕丝蛋白/桑蚕丝蛋白复合支架材料，该材料具有良好的生物相容性和细胞增殖速率，可应用于组织工程领域；Chen 等[6]向SF 溶液内加入甲醇以诱导形成结晶结构，之后通过冷冻融化过程制备冻凝胶用于气管的修复。但是目前多数报道的SF 材料仍然存在韧性差、力学强度低、不易成型及吸水性差等不足之处[7]。

冷冻过程中的增浓效果已经被证实对SF 结晶结构的形成有着促进作用[8]，但纯SF 溶液通过冻融循环并不能形成稳定的冻凝胶，因此需要加入交联剂来促进SF 交联网络的形成。聚乙二醇（PEG）是一种具有较好生物相容性的高分子材料，常与SF 共混以提高其性能。Burke 等[9]通过将PEG 与SF 共混来提高材料的亲水性；Wang 等[10]研究表明，低分子量的PEG 可以促进SF 结晶结构的形成。但鲜有报道PEG 对复合材料力学性能影响机制的研究。

本文以PEG 为交联剂，在不添加其他有机溶剂和化学交联剂的前提下，仅通过简单的冷冻融化过程成功地制备出具有多孔结构的高强度SF 冻凝胶[11]。冷冻过程中SF 和PEG 之间的氢键作用促进了SF 由无定型结构向结晶结构的转变，从而显著增强了冻凝胶的力学强度。溶胀后的冻凝胶压缩模量可达到0.44 MPa，与天然软骨（0.4～0.8 MPa）相似[12]，同时冻凝胶在压缩实验中回复性能良好，可在压缩至90%时不发生永久性形变和破裂；另外亲水性PEG 的引入能够提高冻凝胶的溶胀能力，这有助于细胞和营养组分迅速进入支架内部，为细胞的黏附和生长奠定基础[13]。本研究为丝蛋白凝胶在组织工程等领域的应用提供了新的思路。

1 实验部分

1.1 实验材料

蚕茧：山东汉兴生物技术有限公司；碳酸钠、溴化锂、PEG（Mn=600）：麦克林公司；透析袋：截留分子量为8×103～1.2×104，北京蓝弋科贸。所用试剂皆为市售分析纯。

1.2 SF 水溶液的制备

称取10 g 干蚕茧于2 L 碳酸钠水溶液（5 g/L）中沸水脱胶30 min，将脱胶后的蚕丝用去离子水清洗2 遍并在60 ℃烘箱内烘干至恒重；将7 g 上述烘干蚕丝溶解于9.3 mol/L 的溴化锂溶液中，70 ℃持续搅拌2 h，通过离心（10 min，104r/min）除去SF 溶液中不溶的杂质；最后在清水中透析3 d，每天换水3 次去除溴化锂从而获得SF 水溶液。

1.3 SF/PEG 冻凝胶的制备

通过在PEG 溶液内（w=0.1，膜截留分子量为2×104）反透析提高SF 水溶液的质量分数（wSF）至0.08，0.12和0.16。取5 mL 上述不同质量分数的SF 水溶液在300 r/min 的搅拌速率下，按PEG 与SF 的质量比（mPEG/mSF）分别为0、0.10、0.25、0.50 加入一定量PEG 水溶液得到均匀的混合溶液；然后将该混合溶液装入10 mL离心管内并分别在-20 ℃和-56 ℃下冷冻12 h 或浸入液氮（-196 ℃）内10 min；最后在室温下融化后取出冻凝胶，并用去离子水清洗以去除未交联的SF 和PEG。

1.4 SF/PEG 水凝胶的制备

取5 mL SF 水溶液（wSF=0.08），在300 r/min 的搅拌速率下，按mPEG/mSF分别为0、0.10、0.25、0.50，加入一定量PEG 水溶液以得到均匀的混合溶液，然后将混合溶液装入10 mL 离心管内并置于50 ℃烘箱内2 h即可获得SF/PEG 水凝胶。

1.5 测试与表征

冻凝胶经冷冻干燥后放入液氮中脆断，之后用导电胶固定在样品台上进行喷金处理，采用扫描电镜（日本日立公司S-3500 型）观察断面形貌；样品冻干后与KBr 混合压片，采用傅里叶变换红外光谱仪（美国赛默飞公司Thermo Scientific Nicolet iN10-MX 型）进行红外光谱测试，扫描范围为500～4 000 cm-1；通过万能材料试验机（德国Zwick 公司Z005 型）测试凝胶的力学性能，传感器上限为300 N，样品切割成圆柱体（高10 mm, 直径10 mm），压缩和拉伸速率均为20 mm/min，每组样品不少于3 个并统计平均值以保持重复性；取冻凝胶样品放入60 ℃烘箱烘干至恒重，称重记为m0，再将烘干后的样品放入1 L 去离子水中浸泡，每隔30 s 取出样品，用滤纸吸干表面水分，称重记为mt，如此反复直至质量保持恒定，绘制出溶胀比（mt/m0）随时间（t）的变化曲线。

2 结果与讨论

2.1 冻凝胶的形成机理

图1（a）是SF/PEG 冻凝胶（wSF=0.08）的红外谱图，纯SF 水溶液制备的冻凝胶在代表无规卷曲结构的1 650 cm-1处出现很强的吸收峰，而加入PEG 的冻凝胶特征峰则明显向表示结晶结构的1 620 cm-1处偏移。

此外，本文对红外谱图进行了曲线积分以定量分析不同mPEG/mSF冻凝胶的构象组成（图1（b）），当mPEG/mSF=0.10 时，冻凝胶的结晶结构含量达到55%，而同浓度下纯SF 冻凝胶的结晶结构含量仅为42%；当mPEG/mSF=0.25 时，结晶结构含量进一步提高至65%。上述结果表明PEG 可促进SF 冻凝胶结晶结构的形成，这可能是由于PEG 分子上的―OH 和SF 分子上―NH 之间的氢键增强了SF 分子间的相互作用，从而促进SF分子构象从无定形结构转变为更稳定的结晶结构，相似的氢键也被证实存在于SF 与羟丙基甲基纤维素[14,15]或丙醇[16]的共混复合材料中。

为了验证这一假设，本文通过红外光谱进一步研究了凝胶构象和氢键的变化。之前的研究表明氢键的形成会降低成键电子云密度，减小化学键力常数，从而导致伸缩振动吸收峰向低波数移动[17]。如图1（c）所示，与SF 水凝胶相比，SF/PEG 冻凝胶的羟基吸收峰从3 441 cm-1移动到3 281 cm-1，这表明在冻凝胶中PEG 与SF 形成了氢键。此外，本文还在50 ℃条件下制备了不同mPEG/mSF的SF/PEG 水凝胶，与纯SF 水凝胶相比，加入PEG 的水凝胶在结晶结构含量上没有明显的改变，这进一步表明冷冻融化过程中的高浓条件增强了分子之间的相互作用，有利于形成氢键从而增强冻凝胶的力学强度。

图 1 SF/PEG 冻凝胶（wSF=0.08）的红外谱图（a）与结晶结构含量（b）；纯SF 水凝胶和冻凝胶（wSF=0.08，mPEG/mSF=0.50，TFreeze=-20 ℃）的红外谱图Fig. 1 FT-IR spectra （a） and β-sheet content （b） of SF/PEG cryogels （wSF=0.08）（b）; FT-IR spectra of hydrogel and cryogel （wSF=0.08,mPEG/mSF=0.50，TFreeze=-20 ℃）（c）

2.2 冻凝胶的微观形貌

不同mPEG/mSF冻凝胶的微观形貌如图2（a）所示，冻凝胶的孔径随着mPEG/mSF的降低而减小，从而网络结构变得更加密集。当mPEG/mSF=0.10 时，样品呈现片状网络结构；随着mPEG/mSF提高至0.25 和0.50，冻凝胶出现高度连通的孔状结构，其中mPEG/mSF=0.50 的冻凝胶孔壁最为致密，表明此时SF 与PEG 之间相互作用更加强烈，有利于形成致密凝胶网络。

图 2 mPEG/mSF（TFreeze=-20 ℃， wSF=0.08）（a）、 TFreeze（wSF=0.08， mPEG/mSF=0.50）（b）和wSF（TFreeze=-20 ℃， mPEG/mSF=0.50）（c）对 SF/PEG 冻凝胶微观形貌的影响Fig. 2 Effects of mPEG/mSF（TFreeze=-20 ℃, wSF=0.08）（a）, TFreeze （mPEG/mSF=0.50, wSF=0.08）（b） and wSF （TFreeze=-20 ℃, mPEG/mSF=0.50）（c） on the microstructure of SF/PEG cryogels

图2（b）为不同TFreeze下制备的冻凝胶的扫描电镜图，随着冷冻温度的降低，冻凝胶孔径急剧减小，同时网络结构也更加密集。综上所述，当TFreeze为-20 ℃，mPEG/mSF=0.50 时冻凝胶具有分布均匀、互相连通的开孔结构，满足了组织修复材料的需求。

wSF对冻凝胶微观形貌的影响如图2（c）所示，样品的孔径随着wSF的提高而降低，同时网络结构也变得更加致密。这是由于随着wSF增加，单位体积内SF 分子增多，从而导致作为多孔结构模板的冰晶生长受抑制，孔径尺寸也随之变小。

2.3 冻凝胶的力学性能

如图3（a）所示，冻凝胶可以承受90%以上的压缩形变而不发生断裂和变形，其循环压缩曲线（图3（b））也表明冻凝胶回复性能优异。与SF 水凝胶相比，SF/PEG 冻凝胶具有更加优异的力学性能。由SF/PEG 水凝胶和冻凝胶的压缩应力-应变曲线（图3（c））可知，水凝胶在200 kPa 的应力下即发生断裂，而冻凝胶则可以承受高达3 500 kPa 的应力，这是由于SF 与PEG 之间的氢键作用增强了冻凝胶的力学强度，这种具有较高韧性和优异回弹能力的冻凝胶为其用于组织修复提供了良好的结构基础[18]。

不同TFreeze和mPEG/mSF条件下SF 冻凝胶的力学性能如表1 所示，冻凝胶的拉伸断裂应力和断裂伸长率随着mPEG/mSF的增加而提高；在压缩实验中，mPEG/mSF=0.10 的冻凝胶压缩强度为246.75 kPa，而mPEG/mSF为0.25 和0.50 的冻凝胶则可承受高达3 500 kPa 的应力而不发生破裂。在-56 ℃和液氮冷冻条件下制备的冻凝胶强度太差，无法进行拉伸试验，在压缩实验中，冻凝胶的强度随着TFreeze的降低而降低。综上所述，相同SF 质量分数下，当mPEG/mSF和TFreeze分别为0.50 和-20 ℃时，冻凝胶具有最佳的压缩强度。

表2 所示是wSF对冻凝胶的力学性能的影响。冻凝胶的力学性能随着wSF的提高而显著提高。这是由于随着wSF的增加，单位体积内SF 分子链密度增加，其形成的网络结构更为致密。当wSF=0.16 时，冻凝胶的拉伸模量可以达到4.15 MPa，高于大多数的常规天然高分子水凝胶（10～100 kPa）[19]或者双网络结构的水凝胶（100～1 000 kPa）[20,21]。此外，冻凝胶在保持优异的拉伸模量的同时还具有较高的断裂伸长率，即使拉伸模量达到4.15 MPa 依然可以拉伸至100%，从而赋予SF/PEG 冻凝胶出色的韧性（680.81 kJ/m3），这与目前报道的两相溶剂诱导制备的SF 水凝胶相当（600 kJ/m3）[22]。

图 3 SF/PEG 冻凝胶（wSF=0.16，mPEG/mSF=0.50，TFreeze=-20 ℃）的压缩图片（a）和循环压缩应力-应变曲线（b）；SF/PEG 冻凝胶（wSF=0.08，mPEG/mSF=0.50，TFreeze=-20 ℃）和SF/PEG 水凝胶（mPEG/mSF=0.50）的压缩应力-应变曲线（c）Fig. 3 Digital photos （a） and cycle compressive stress-strain curves （b） of SF/PEG cryogel （wSF=0.16，mPEG/mSF=0.50，TFreeze=-20 ℃）;Compressive stress-strain curves of SF/PEG cryogel （wSF=0.08， mPEG/mSF=0.50， TFreeze=-20 ℃） and SF/PEG hydrogel（mPEG/mSF=0.50）（c）

表 1 mPEG/mSF 和TFreeze 对冻凝胶力学性能的影响Table 1 Effects of mPEG/mSF and freezing temperature on mechanical properties of cryogels

表 2 wSF 对冻凝胶力学性能的影响Table 2 Effects of wSF on the mechanical properties of cryogels

2.4 冻凝胶的溶胀性能

由于细胞生长在水环境中，组织修复材料要求具有一定的吸水能力以利于细胞和营养组分迅速进入支架内部，从而为细胞的黏附和生长奠定基础。因此，快速的溶胀吸水速率对于组织修复材料显得极其重要。由冻凝胶的溶胀动力学曲线（图5（a））可知，当mPEG/mSF=0.10 时，样品浸泡时几乎不发生溶胀，这是因为其在烘干后体积急剧缩小（图5（b）），丧失了原有片层结构，从而显著增加水分子的扩散阻力（图5（c））；当mPEG/mSF提高至0.25 和0.50 时，冻凝胶的平衡吸水溶胀比从7.06 g/g 升高至9.15 g/g，同时溶胀平衡的时间也从200 s 降低为160 s。这是由于较高mPEG/mSF的冻凝胶的孔径较大，更有利于水分的吸收，同时PEG 的亲水性也提高了样品的溶胀速率。

图 4 mPEG/mSF 对冻凝胶溶胀性能的影响（a）；样品烘干前后照片（b）；冻凝胶烘干前后的扫描电镜图（c）Fig. 4 Effects of mPEG/mSF on the swelling properties of the cryogels （a）; Digital photos of the cryogels with different mPEG/mSF before and after drying （b）; SEM images of the cryogels before and after drying（c）