钛金属表面骨诱导型可降解壳聚糖涂层的构建及生物活性调控

2020-12-31李海霞何宏燕董秀琳常铃雪刘昌胜

功能高分子学报 2020年1期

李海霞，何宏燕，董秀琳，常铃雪，刘昌胜

（华东理工大学材料科学与工程学院，教育部医用生物材料工程研究中心，上海 200237）

钛金属材料具有质轻、无毒、易加工、生物相容性好、弹性模量与人骨相近等一系列优点，已被广泛用于固定材料和矫形/牙科植入物[1,2]，但钛植入材料在植入初期稳定性不佳、成骨活性不足，进而导致初期长入缓慢，甚至引起关节松动或脱落[3,4]。仅仅依靠金属材料的表/界面结构，缩短种植周期、促进早期骨整合的作用有限，最为有效的方法是引入生长因子[5]，该方法可加强种植材料与周围细胞相互交流的生物学信号，进而促进骨组织与植入体之间的骨性键合。

骨形态发生蛋白（BMP）是目前公认的有效促进细胞生长、诱导成骨分化的的局部生长因子，其高效的成骨活性已被充分认可[6-8]。蛋白质的固载方式分为：非共价固载[9-11]和共价固载[12]。非共价固载蛋白质的量有限、停留时间短、易发生突释；共价固载蛋白质条件苛刻、操作复杂、反应条件较剧烈。要实现蛋白质的高效固载，需要瞬间固定，且需要一定的时间与周围细胞发生作用使诱导活性得到充分发挥。采用静电喷涂（ES）法制备材料的周期短、条件温和、涂层厚度可控，该方法可以把BMP 快速、稳定固载于金属表面[13]，但需要均一、稳定的导电溶液。壳聚糖（CS）是一种天然高分子多糖，具有优异的生物相容性和可降解性，是固载蛋白质良好的载体[14]，其氨基质子化（NH2与H+结合）形成NH3+结构，使得CS 溶液带正电。

在钛金属表面构建微米/亚微米级的结构有利于细胞早期黏附，促进成骨[15]。喷砂酸蚀（SLA）可构建微米级别的形貌，改善表面粗糙度，增加比表面积。植入活性亲水的钛金属材料更有利于细胞黏附、增殖，加速骨结合[16]。阿仑膦酸钠（ALN）分子结构中有大量的亲水性基团，物理吸附可以明显改善材料表面的亲水性，抑制破骨细胞，促进成骨，已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床试验[17]。本文首先将工业纯钛片（Ti）通过SLA 处理制得SLA-Ti，然后SLA-Ti 物理吸附ALN 进行亲水性处理制得ALN-SLA-Ti，最后采用静电喷涂法将CS 与蛋白质的混合溶液快速、稳定地喷涂于ALN-SLA-Ti 表面制得CS 涂层。通过扫描电子显微镜表征各钛片的表面形貌，选用小鼠成肌细胞（C2C12）和大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）与钛片共培养，评价钛片改性后的表面对细胞黏附、增殖与成骨分化能力的影响。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

Ti：TA2 型，威高集团；CS：η＞400 mPa·s 上海阿拉丁生化科技有限公司；ALN：分析纯，上海泰坦科技有限公司；冰乙酸：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）：生化级，上海瑞邦有限公司；四唑盐（MTT）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鬼笔环肽、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、二甲基亚砜（DMSO）：生化级，美国Sigma-Aldrich 公司；C2C12 细胞：美国模式培养物集存库；rBMSCs：本实验室自行提取，上海斯莱克公司；牛血清白蛋白（BSA）、碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒：上海碧云天生物技术研究所。

1.2 仪器

美国KDS 公司100 型恒流注射泵；日本日立公司S-4800 型扫描电子显微镜；上海中晨数字设备JC2000D2型水接触角测量仪；美国Molecular Devices 公司SPECTRAmax 384 型酶标仪；日本Nikon 公司A1R 型共聚焦激光扫描显微镜。

1.3 SLA-Ti 的表面处理

用超纯水配制质量浓度为0.02 μg/mL 的ALN 溶液，然后用0.22 μm 过滤膜无菌过滤该溶液，SLA-Ti 在过滤后的ALN 溶液中4 ℃浸泡2 h，浸泡后的SLA-Ti 在无菌超净台通风干燥约15 min，干燥后的钛片标记为ALN-SLA-Ti。

1.4 涂层制备

用超纯水配制w=0.5%的醋酸溶液，称取60 mg CS 溶解于4 mL 的醋酸溶液中，制备w=1.5%的CS 溶液，根据实验需求再加入BSA 或rhBMP-2 制备成CS 和蛋白质的混合溶液。将微流注射器置于钛片正上方，在静电场作用下喷涂一定时间制得涂层。喷涂工艺参数：喷涂速率为0.3 mL/h，正电压为10～11 kV，不锈钢针头与钛片表面的距离为20～30 mm。当喷涂时间分别为3、5、10 min 时，喷涂后的SLA-Ti 分别标记为SLATi-3、SLA-Ti-5、SLA-Ti-10，喷涂后的ALN-SLA-Ti 分别标记为ALN-SLA-Ti-3、ALN-SLA-Ti-5、ALN-SLA-Ti-10，其制备示意图如图1 所示。

图 1 钛片表面可降解生物涂层的构建示意图Fig. 1 Schematic diagram of constructing degradable bio-coating on titanium surface

1.5 蛋白质的体外释放研究

1.5.1 固载方式对BSA 体外释放的影响分别配制BSA 溶液、BSA-CS 混合溶液，其中BSA 的质量浓度为30 mg/mL，通过物理吸附BSA 溶液（方式A）、蛋白滴加BSA 溶液（方式B）、蛋白滴加BSA-CS 混合溶液（方式C）、静电喷涂BSA-CS 混合溶液（方式D）、静电喷涂后冻干BSA-CS 混合溶液（方式E）固载BSA 于ALNSLA-Ti 表面，处理时间为5 min，研究BSA 的体外释放情况。用酶标仪在波长562 nm 处测定每孔的光学密度（OD），根据BSA 标准曲线计算蛋白质释放量。

1.5.2 喷涂时间对BSA 体外释放的影响配制BSA-CS 混合溶液，其中BSA 的质量浓度为30 mg/mL，在ALN-SLA-Ti 表面采用静电喷涂的方式分别喷涂3、5、10 min 固载BSA，研究BSA 的体外释放情况。用酶标仪在波长562 nm 处测定每孔的OD 值，根据BSA 标准曲线计算蛋白质释放量。

1.6 生物学行为评价

1.6.1 细胞黏附与增殖将Ti、SLA-Ti、ALN-SLA-Ti、ALN-SLA-Ti-5（固载约2 μg rhBMP-2）分别与1 mL 悬浮液（约含20 000 个C2C12 细胞）在24 孔板中培养12 h 后，对孔板中的细胞进行固定、染色、表面黏附形态观察。将Ti、SLA-Ti、ALN-SLA-Ti、SLA-Ti-5、ALN-SLA-Ti-5（固载约2 μg rhBMP-2）分别与1 mL 细胞悬浮液（约含20 000 个C2C12 细胞）在24 孔板中共培养 1、3 d，加入100 μL MTT 溶液，在37 ℃下孵育4 h；吸去多余溶液，加入500 μL DMSO，在37 ℃恒温震荡15 min；蓝紫结晶物溶解后，从24 孔板中取200 μL 溶液加入96 孔板中，用酶标仪在波长492 nm 下测定每孔的OD 值。

1.6.2 ALP 活性检测采用ALP 活性法对各钛片表面细胞的成骨分化能力进行测试。将Ti、SLA-Ti、ALNSLA-Ti、SLA-Ti-5、ALN-SLA-Ti-5（固载约2 μg rhBMP-2）与1 mL 悬浮液（含30 000 个rBMSCs 细胞）在24 孔板中共培养4、7、14 d，每隔3 d 换1 次培养液。共培养结束后，吸去多余溶液，PBS 清洗2 次，每孔加500 μL裂解液，37 ℃恒温震荡90 min；每孔取10 μL 溶液，孵育30 min 后，在波长562 nm 下测定每孔的OD 值；从24 孔板中取50 μL 溶液至96 孔板后，再加100 μL 的ALP 工作液孵育2 h，在波长405 nm 处测定每孔的OD值，进而计算钛片表面的ALP 的活性值。

2 结果与讨论

2.1 钛片的表面形貌

图2（a1～a3）展示了SLA-Ti 喷涂不同时间的表面形貌。SLA-Ti-3 表面只保留少许孔洞结构，0.2～4 μm的孔洞微结构基本被覆盖；随着喷涂时间增加，SLA-Ti 表面结构被涂层完全覆盖，基本为平面形貌。图2（a4～a6）展示了ALN-SLA-Ti 喷涂不同时间的表面形貌，ALN-SLA-Ti-3 表面留有较多孔洞结构；ALNSLA-Ti-5 表面形成直径约5 μm 的微球涂层，且该表面仍有孔洞结构，增加了钛片表面粗糙度和比表面积，为后期细胞的黏附和增殖提供了有利的条件；ALN-SLA-Ti-10 表面覆盖了微球和孔洞结构，钛片表面不均匀。

图 2 SLA-Ti（上）与ALN-SLA-Ti（下）喷涂不同时间的表面形貌Fig. 2 Surface morphology of SLA-Ti （up） and ALN-SLA-Ti （down） after spraying differen time

2.2 钛片表面的亲疏水性

表1 比较了不同钛片表面的接触角。SLATi 表面接触角约为101°，其表面疏水；ALN-SLATi 表面接触角约为16°，亲水性显著增加。在SLATi 表面喷涂3、5、10 min 时，接触角分别约为107°、100°、97°，CS 涂层的厚度并不能明显改善SLA-Ti 表面的亲疏水性。在ALN-SLA-Ti 表面喷涂3、5、10 min 时，接触角分别约为 37°、59°、87°，接触角随着涂层厚度增加而逐渐增大。已有研究表明材料表面的亲疏水性对细胞的黏附有很大影响，当接触角在 30°～70°时更有利于细胞黏附[18]。因此，ALN-SLA-Ti-5 的亲水性表面为后期细胞的黏附提供了有利的条件。

表 1 不同钛片表面的接触角Table 1 Contact angles of different titanium surfaces

2.3 蛋白质的控释行为

图3（a）比较了不同固载方式对蛋白质释放行为的影响。通过方式A 固载BSA 时，BSA 的突释量约69%，突释现象最为严重，12 h 内几乎完全释放。通过方式B 固载BSA 时，BSA 的突释量约为56%，1 d 内几乎完全释放。通过方式C 固载BSA 时，BSA 的突释量约为43%，5 d 内几乎完全释放。通过方式D 固载BSA 时，BSA 突释量约为25%，7 d 后BSA 的释放量约为81%；通过方式E 固载BSA 时，冻干前后BSA 释放量相似。因此，CS 载体对蛋白质的释放起到一定的缓释作用，冻干对蛋白质的释放行为没有显著影响。

图3（b）比较了喷涂时间对蛋白质释放行为的影响。喷涂3 min 后，BSA 的突释量约37%，钛片表面涂层偏薄，释放迅速，7 d 后BSA 的释放量约为95%；喷涂5 min 后，BSA 的突释量约26%；喷涂10 min 后，BSA 的突释量约为16%。喷涂5、10 min 后的钛片表面涂层较厚，减缓了BSA 的释放速率，7 d 后其释放量约为80%。因此，通过调节喷涂时间可控制蛋白质的释放量。

2.4 涂层的降解行为

图4 显示了ALN-SLA-Ti-5 表面的降解情况。随着降解时间的增加，钛片表面构建的CS 涂层逐渐降解。3 d 后，钛片表面在一定程度上维持着微球形貌；7 d 后，钛片表面剩余的涂层量较少，微球形貌基本消失；10 d 后，钛片表面有少量的CS 涂层，仍具有一定的可降解性。因此，蛋白质随着CS 涂层的降解持续释放，为后期细胞的黏附、增殖和早期成骨分化不断提供生长因子。

图 3 固载方式（a）和喷涂时间（b）对钛片表面蛋白质释放行为的影响Fig. 3 Effects of loading methods （a） and spraying time （b） on the released behavior of titanium surface

图 4 CS 涂层在PBS 缓冲液中的降解行为Fig. 4 Degradation behavior of CS coatings in PBS buffer

2.5 细胞的黏附与增殖

图 5 C2C12 细胞在钛片表面共培养12 h 后的黏附形态Fig. 5 Adhesion morphology of C2C12 cells after co-culture on the surface of titanium for 12 h

图5 比较了C2C12 细胞在钛片表面共培养12 h后的黏附形态。SLA-Ti 表面黏附的细胞数量明显多于Ti 表面黏附的细胞数量；ALN-SLA-Ti 表面黏附的细胞数量略多于SLA-Ti 表面黏附的细胞数量；ALN-SLATi-5 表面黏附的细胞数量最多。图6（a）比较了C2C12 细胞在钛片表面共培养1、3 d 后的增殖情况。共培养1 d 后，SLA-Ti、ALN-SLA-Ti、SLA-Ti-5、ALN-SLA-Ti-5 表面细胞的活性略高于Ti 表面细胞的活性。共培养3 d后，前述样品表面细胞的活性明显高于Ti 表面细胞的活性，其中ALN-SLA-Ti-5 表面细胞的增殖效果最明显。

2.6 钛片表面的成骨分化能力

图6（b）比较了rBMSCs 细胞在钛片表面共培养1、7、14 d 后的成骨分化情况。共培养1 d 后，5 组钛片表面细胞的ALP 活性没有显著差异，因为细胞与钛片共培养时间短，细胞还处于黏附增殖期，rhBMP-2 对细胞的促成骨分化能力较弱。共培养7 d 后，SLA-Ti、SLA-Ti-5、ALN-SLA-Ti 表面细胞的ALP 活性略高于Ti 表面细胞的ALP 活性，ALN-SLA-Ti-5 表面细胞的ALP 活性最高，成骨分化能力明显。共培养14 d 后，Ti、SLA-Ti、SLA-Ti-5 表面细胞的ALP 活性变化较小，而ALN-SLA-Ti 表面细胞的ALP 活性略有增加，ALNSLA-Ti-5 表面细胞的ALP 活性最高，成骨分化能力明显。

图 6 C2C12 细胞在钛片表面共培养1、3 d 后的增殖行为（a）；rBMSCs 细胞在钛片表面共培养1、7、14 d 时的ALP 活性（b）Fig. 6 Proliferation of C2C12 cells after co-culture on the surface of titanium for 1 d and 3 d (a); ALP activity of rBMSCs cells on the surfaces of titanium for 7 d and 14 d (b)