抗菌肽PAF26对采后李果实褐腐菌的抑菌效果及机理

蔡 蜨，李心丹，邓丽莉,3，曾凯芳,3,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.食品科学与工程国家级实验教学示范中心（西南大学），重庆 400715；3.西南大学食品贮藏与物流研究中心，重庆 400715）

李子是蔷薇科植物李的果实，我国大部分地区均产[1]。李果实成熟于夏季高温季节[2-3]，是一种高度易腐、采后寿命短的农产品[4]。李果实采后腐烂造成了重大的经济损失[5]，其中，较为严重的是褐腐病，且主要致病菌是美澳型核果链核盘菌（Monilinia fructicola（Winter）Honey）[6]。核桃腐病菌（M.fructicola）具有很快的生长速度和传播速度[7-8]，病原体会感染田间的花、嫩枝和果实，并产生包括花苞凋谢、木质组织溃烂和果实腐烂等各种症状，普遍的损害发生在贮藏和运输的采后阶段[9]。在现有的李果实褐腐病的防治中，化学杀菌剂的使用是最普遍、也是最有效的，如过氧乙酸[3]、1-甲基环丙烯、戊唑醇[10]和L-半胱氨酸[5]处理等。但化学杀菌剂的长期使用会导致病原菌产生一定的抗性，且化学杀菌剂本身会给环境和人体健康带来潜在威胁，因此研究者们开始致力于寻找环保、无污染、安全有效的物质来减少或代替化学杀菌剂的大量使用。

抗菌肽又可称为抗微生物肽，一般是指由生物有机体产生的一种具有较广抗菌谱或防御功能的小分子肽类物质[11-12]，可以非特异性地抗细菌、真菌、病毒等病原体[13]。抗菌肽可通过与细胞内靶标的特异性结合，干扰细胞代谢从而达到灭菌和杀菌的效果[14]。除此之外，抗菌肽也能通过改变细胞膜的通透性使细胞死亡[15]。近年来，抗菌肽具有的作用快速、安全、无残留以及不耐药等特点使其在医药业、食品工业、畜牧业等领域受到越来越多的关注[15-16]。抗菌肽PAF26（Ac-RKKWFW-NH2）是一种针对植物病原青霉病被组合、筛选、鉴定出的富含色氨酸的阳离子小分子合成六肽，与其他天然或合成来源的抗微生物肽具有序列相似性[17-20]。目前国外已有研究表明，PAF26能够有效对柑橘类水果病害进行控制[21-22]，但有关PAF26在其他果蔬采后病害控制方面鲜有报道，也鲜见将抗菌肽PAF26应用于李果实采后病害控制的有关报道。本实验旨在探究抗菌肽PAF26对李果实采后褐腐病病原菌M.fructicola的抑菌效果和作用机理，从而拓宽抗菌肽PAF26的应用范围，并且为李果实采后病害的控制提供一种新的方法和思路。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

M.fructicola为本实验室自行分离、鉴定和保存的菌种。使用前将菌悬液接种于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基，并于25 ℃条件下培养。5 d后挑选生长旺盛的菌丝再次接种在PDA培养基，于25 ℃下培养7 d。在无菌条件下，用无菌水将M.fructicola洗下配制成高浓度的孢子悬浮液，并根据需要用无菌水调至到所需浓度，现配现用。

‘青脆李’（Prunus salicinaLindell cv.‘Qingcui’）采摘于重庆市巫山县，采摘后当天运回实验室。挑选无病害、无机械伤且大小均匀、成熟度一致的果实。摊平去除田间热后，于室温条件下贮藏待用。

纯度大于90%的抗真菌肽PAF26（Ac-RKKWFWNH2）（固相合成方法合成）购于南京金斯瑞公司，贮藏在-40 ℃冰箱中，使用前先用无菌水配成4 mmol/L的母液，然后稀释至所需浓度。SYTOX Green（SG）荧光染色剂 美国Invitrogen 公司。

1.2 仪器与设备

立式自动压力蒸汽灭菌锅 重庆思美特科技有限公司；SW-CJ-1F超净工作台 苏净集团安泰有限公司；DHP-9082电热恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；B203生物显微镜 重庆奥特光学仪器有限公司；SYNERGYH1MG全自动酶标仪 美国BioTek公司；TS100荧光显微镜 北京长恒荣创科技有限公司；AvantiTMJ-30I高速冷冻离心机 美国Beckman公司；DDS-307A电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽PAF26对M.fructicola的离体抑菌作用分析

实验参考Wang Wenjun等[23]的方法并进行一定修改。使用无菌96 孔微量板进行实验，将180 μL 1×104CFU/mLM.fructicola孢子悬浮液（含体积分数5%马铃薯葡萄糖液体培养基（potato dextrose broth，PDB）与20 μL抗菌肽PAF26溶液，混合后立即加入96 孔板中，使PAF26的终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L和128 μmol/L。对照组以无菌水代替抗菌肽，置于25 ℃恒温培养箱中培养，48 h时用酶标仪测定其OD600nm。以48 h依旧能完全抑制病原菌生长的最低浓度作为最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

将180 μL无菌水稀释的M.fructicola孢子悬浮液（1×103CFU/mL）和20 μL已测出的具有抑菌浓度的抗菌肽（实验组）或无菌水（对照组）在1.5 mL的离心管中混合。置于25 ℃恒温培养箱中培养，16 h后从离心管中吸取50 μL液体涂布在PDA培养基上，于25 ℃继续培养48 h，通过计数菌落形成单位（CFU）来确定分生孢子的生存能力。将抗菌肽PAF26处理后的分生孢子存活率与对照组进行比较。按公式（1）计算分生孢子存活率。每一浓度3 组平行，实验重复3 次。

1.3.2 同孔损伤接种抗菌肽PAF26对李果实褐腐菌的控制效果实验

实验参考Muñoz等[24]的方法并进行一定修改。用体积分数2%次氯酸钠浸泡李果实1 min后用清水冲洗，并于常温下自然晾干。果实表面赤道部位经体积分数75%乙醇溶液擦拭消毒后，将其随机分成3 组，每组15 个果实。用灭菌铁钉在果实赤道部位等距打两个孔（深3 mm、直径3 mm）。将10 μL新鲜孢子悬浮液（1×104CFU/mL）和10 μL抗菌肽混合后立即接种于孔中。以无菌水代替抗菌肽为对照使抗菌肽PAF26的终浓度为64、128 μmol/L。待液体完全吸收后，用聚乙烯薄膜袋将果实单果包装，置于25 ℃、相对湿度为80%～90%的环境中贮藏，统计第3～6天的发病率并测量病斑直径。实验重复3 次。

1.3.3 抗菌肽对M.fructicola细胞结构的影响

1.3.3.1M.fructicola菌丝细胞膜完整性的测定

实验参考Wang Wenjun等[23,25]的方法并进行一定修改。用体积分数为5%的PDB配制1×104CFU/mL的病原菌孢子悬浮液，取90 μL加入到无菌的1.5 mL的离心管中，25 ℃下培养24 h。然后，加入10 μL抗菌肽溶液或无菌水（对照组），使抗菌肽PAF26的终浓度达到0、64、128 μmol/L，继续培养2 h后加入4 μmol/L SG贮备溶液，使其终浓度达到0.2 μmol/L，样品继续在暗环境下培养5 min后，挑取菌丝制片并在荧光显微镜下观察，条件设置：SG的检测激发波长450～490 nm、发射波长515～565 nm；滤光片选择为异硫氰酸荧光素。实验重复3 次。

1.3.3.2M.fructicola孢子细胞膜完整性的测定

实验参考Li Xindan等[26]的方法并进行一定修改。将90 μL的1×107CFU/mL的病原菌孢子悬浮液加入到无菌的1.5 mL离心管中，然后加入10 μL抗菌肽，使抗菌肽在混合液中的终浓度分别达到0、64、128 μmol/L，以无菌水代替抗菌肽为对照，置于25 ℃环境中培养6 h，加入500 mg/L的碘化丙啶（propidium iodide，PI）贮备溶液，使混合液中PI的终质量浓度达到50 mg/L，制片并在荧光显微镜下观察，实验重复3 次。荧光显微镜下检测并拍照：PI的检测（激发波长设置为535 nm、发射波长为615 nm）；滤光片选择G-2A。每张载玻片随机选择5 个视野，在明视野以及相同位置的荧光视野下分别拍照记录。将明视野中观察到的孢子数定义为总数（T），荧光视野下观察到红色的染色孢子作为已被破坏膜结构的孢子数（S）。按照公式（2）计算孢子细胞膜完整性。

1.3.3.3M.fructicola菌丝体胞外电导率的测定

实验参考Paul等[27]的方法并进行一定的修改。采用DDS-307A电导率仪测定M.fructicola胞外电导率。将100 μL 1×105CFU/mL病原菌孢子悬浮液加入到20 mL PDB培养基中，在25 ℃下160 r/min振荡培养48 h。将培养48 h且含菌丝体的PDB培养基在4 000×g的条件下离心15 min，获得的菌丝体沉淀再在相同离心条件下用无菌水离心冲洗3 次。收集菌丝体沉淀，重悬于无菌水中。加入抗菌肽溶液，使其终浓度分别为0、64、128 μmol/L，以无菌水代替抗菌肽溶液为对照。在处理0、0.5、1、2、3、6 h和9 h 时测定胞外电导率。每一浓度3 组平行，实验重复3 次。

1.3.4 抗菌肽PAF26溶血性测定

实验参考Muñoz等[28]的方法并进行一定修改。将从西南大学南区校医院获得的健康成人新鲜血液混合到含有抗凝血剂的离心管中，1 000×g离心5 min，弃上清液，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3 次，然后用4 倍体积PBS重悬，获得红细胞悬浮液。取10 μL浓度分别64、128 μmol/L的抗菌肽溶液或0.1 mol/L PBS（阴性对照）、0.1% Triton X-100（阳性对照），与90 μL红细胞悬浮液混合后于37 ℃培养1 h。然后1 000×g离心5 min。转移上清液至无菌的96 孔微量板，用酶标仪测定540 nm波长处的OD值。每一浓度3 组平行，实验重复3 次，按照公式（3）计算溶血率。

1.4 数据处理与分析

所有数据用Excel 2010软件进行统计，运用GraphPad Prism 8软件绘图；用SPSS 25.0软件对数据进行单因素方差分析，利用Duncan’s多重比较对差异显著性进行分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽PAF26对M.fructicola的离体抑菌作用

由图1A可知，当PAF26的浓度为64 μoml/L时，M.fructicola生长完全受抑制，即抗菌肽PAF26的MIC为64 μmol/L。由图1B、C可知，与对照相比，浓度为64、128 μmol/L的抗菌肽能够显著降低分生孢子存活率（P＜0.05），且64 μmol//L PAF26降低M.fructicola孢子存活率的能力显著强于128 μmol/L PAF26（P＜0.05）。

图1 抗菌肽PAF26对M.fructicola的离体抑菌作用Fig.1 Antifungal activity in vitro of peptide PAF26 on M.fructicola

2.2 抗菌肽PAF26对李果实褐腐菌的控制效果

如图2A所示，经同孔损伤接种后，处理3～6 d内，PAF26处理过的果实发病率显著低于对照组（P＜0.05），且64 μmol/L处理明显比128 μmol/L处理效果好。如图2B所示，处理的第3、4、6天，PAF26处理过的果实病斑直径与对照组相比均无显著性差异（P＞0.05）。但在处理第5天时，64 μmol/L处理过的果实病斑直径显著小于对照组（P＜0.05）。如图2C所示，处理6 d后，经64、128 μmol/L抗菌肽处理后的李果实发病孔数明显少于对照组，而病斑直径无明显差别，与发病率和病斑直径的测定结果一致。

图2 抗菌肽PAF26对李果实采后褐腐菌发病率和病斑直径的影响Fig.2 Effect of peptide PAF26 on disease incidence and lesion diameter of plum fruit caused by M.fructicola

2.3 抗菌肽PAF26对M.fructicola菌丝细胞膜的影响

图3 抗菌肽PAF26对M.fructicola菌丝体细胞膜的影响Fig.3 Effect of peptide PAF26 on membrane permeability of M.fructicola mycelia

当细胞膜通透性被破坏后，SG荧光染色剂可进入细胞内与核酸物质结合，呈现出大于未结合核酸物质时500 倍强度的绿色荧光。如图3所示，未经PAF26处理的对照组的M.fructicola菌丝经SG染色后，没有出现明显的绿色荧光；经过浓度为64、128 μmol/L的抗菌肽处理过后的实验组，呈现出明显的绿色荧光。表明经抗菌肽处理后的M.fructicola菌丝细胞膜已被破坏。

2.4 抗菌肽PAF26处理对M.fructicola孢子细胞膜完整性的影响

图4 抗菌肽PAF26处理对M.fructicola孢子细胞膜的影响Fig.4 Effect of peptide PAF26 treatment on membrane permeability of M.fructicola spores

图5 抗菌肽PAF26处理对M.fructicola孢子细胞膜完整性的影响Fig.5 Effect of peptide PAF26 treatment on membrane integrity of M.fructicola spores

当M.fructicola孢子细胞膜破损后，PI荧光染色剂可进入细胞内与核酸物质结合，发出红光。由图4可知，对照组并未发现发出红光的细胞，经浓度为64、128 μmol/L的抗PAF26菌肽处理后，均发现发出红光的细胞。且由图5可知，对照组的M.fructicola孢子细胞膜完整性基本保持在100%，而经过64、128 μmol/L PAF26处理后M.fructicola孢子细胞膜完整性均降低至85%左右，与对照组相比差异显著（P＜0.05）。

2.5 抗菌肽PAF26对M.fructicola菌丝体胞外电导率的影响

如图6所示，随着处理时间的延长，对照组和PAF26的两个不同浓度处理组的M.fructicola菌丝体胞外电导率都逐渐增大。且经两个不同浓度的PAF26处理后胞外电导率均显著高于对照组（P＜0.05）。在处理9 h后，对照和64、128 μmol/L PAF26处理组胞外电导率达到最大，分别为51.60 μS/cm和63.50、89.03 μS/cm。

图6 抗菌肽PAF26对M.fructicola菌丝体胞外电导率的影响Fig.6 Effect of peptide PAF26 treatment on extracellular conductivity of M.fructicola mycelia

2.6 抗菌肽PAF26溶血性实验结果

图7 抗菌肽PAF26的溶血性Fig.7 Hemolytic activity of peptide PAF26

实验以0.1 mol/L PBS作为阴性对照，不会导致溶血现象发生，以0.1% Triton X-100作为阳性对照，有极强的溶血性。如图7所示，两个浓度的抗菌肽PAF26的溶血率均显著低于0.1% Triton X-100（P＜0.05），且128 μmol/L PAF26溶血率显著低于64 μmol/L PAF26（P＜0.05）。当PAF26浓度为64、128 μmol/L时，溶血率分别为1.62%、0.96%。

3 讨 论

本实验以探究抗菌肽PAF26对李果实采后褐腐菌的抑菌效果为目的，进而研究PAF26的作用机理。结果表明，抗菌肽PAF26在离体条件下对李果实褐腐病病原菌M.fructicola具有一定的抑菌效果，其中MIC为64 μmol/L，该浓度下能够显著降低孢子存活率，但不能完全杀菌，这与LfcinB20-25的作用效果[29]相似。不同浓度PAF26的抑菌效果表现出差异，但浓度增到128 μmol/L后抑菌效果反而没有64 μmol/L好，这与乳铁蛋白原肽的抑菌效果[29]相似。这样的结果很有可能是因为肽的浓度存在有效范围。在果实的同孔接种实验中发现，PAF26能够显著抑制李果实M.fructicola导致的发病率，但对病斑直径影响不大。这与前人发现抗菌肽PAF26具有一定的抗真菌活性，能在体外特异性靶向和抑制丝状真菌的结果[17,30]相似。

通过荧光显微镜观察，发现抗菌肽PAF26能够增加M.fructicola菌丝体细胞膜的通透性，使SG进入细胞内，发出强烈的绿色荧光，这一结果与前人所描述的抗菌肽可通过破坏细胞膜通透性从而达到抑菌和杀菌效果的结论[31]相似。通过荧光显微镜观察，还发现PAF26处理可破坏M.fructicola孢子细胞膜，使PI染色剂进入孢子内与核酸物质结合，发出红光，从而延缓M.fructicola孢子的萌发，这与前人所研究的抗菌肽O3RT和C12O3TR可引起细胞渗透平衡的破坏，最终导致细胞死亡的作用机理[26]相似。细胞膜是防止细胞外物质自由进入细胞的屏障，它保证了细胞内环境的相对稳定。细胞损伤的早期表现[6]表明当其通透性发生异常变化时，会导致细胞内含物大量泄漏从而影响细胞的正常生理活性。抗菌肽PAF26处理可显著增加菌丝体胞外电导率，促使其菌丝体膜内物质泄漏，这一结果表明菌丝体细胞膜在一定程度上受到破坏，这与PAF56[23]、BP21[25]的作用效果相似。由于某些天然抗菌肽存在抗菌活性不高、会对宿主细胞产生一定的毒性和溶血性等缺陷[32-33]，在一定程度上限制了抗菌肽的应用。但本研究表明，抗菌肽PAF26具有特异性细胞溶解活性，对人血红细胞几乎不存在溶解性，具有潜在的应用价值。这与PAF26溶血性结果[28]相似。

综上，抗菌肽PAF26可以通过增加M.fructicola菌丝细胞膜通透性和破坏M.fructicola孢子细胞膜，引起胞内物质泄漏，从而达到对M.fructicola生长的抑制。PAF26几乎不存在溶血现象，是一种比较环保、高效的抗菌肽。因此认为，抗菌肽PAF26在李果实采后褐腐菌的抑制方面具有很大的开发应用价值。