低频高强度超声波对鸡胸肉肌原纤维蛋白性质的影响

李 可，李三影，扶 磊，赵颖颖，张艳艳，赵电波，白艳红*

（郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南省冷链食品质量安全控制重点实验室，河南 郑州 450001）

超声波技术是一种绿色的食品物理加工技术。基于低频率高强度超声波（频率20～100 kHz、强度＞1 W/cm2）处理下改善各种食品蛋白质功能特性（溶解性、保水性、凝胶特性、乳化特性、起泡性等）的研究成为食品物理加工技术领域的热点[1-2]。高强度超声波通过“空化效应”产生机械、化学、热作用等，引起植物蛋白、畜禽蛋白和水产品蛋白结构性质的改变[3-5]。一方面，近几年国内外学者已关注不同超声波处理条件（功率、时间、频率等）对畜禽肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）功能特性和理化性质的影响[6-10]。但是，不同研究报道关注的重点影响性质不同，如溶解性[11]、保水性[12-13]、流变特性[14]、凝胶特性[15]以及乳化特性[16]等。本课题组前期研究发现超声波处理（频率20 kHz、功率450 W、时间6 min）能够降低鸡肉MP粒径，有效改善鸡肉MP的乳化活性和乳化稳定性，提高乳化液的粒径分布均匀性和动态流变学特性[17]。同时，部分研究进一步关注不同超声波参数处理后蛋白质二级、三级结构或分子间化学作用力、流变学特性的变化以探明改善蛋白质功能特性的机制。另一方面，应用低频高强度超声波可以改善新鲜肉和加工肉类的感官品质、物理化学特性和优化加工工艺，降低食盐、磷酸盐添加量等[18-21]。最近，Barekat等[22]发现采用超声波嫩化牛背最长肌肉时，牛肉肌原纤维蛋白乳化能力得以增强。Cichoski[23]和Pinton[24]等参考了本课题组前期研究的超声波参数[25]，应用超声波处理改善了猪肉糜乳化体系的品质特性。MP是肌肉中的主要蛋白质，约占蛋白总量的50%～60%，对肉类总乳化能力的发展起着90%以上的作用[17]。因此，针对MP乳化特性方面，有必要进一步探讨超声波技术对MP乳化性能和蛋白性质的影响，揭示超声波处理改善肌肉加工保水、保油性能的机制。

关于超声波对畜禽MP的电位、油-水界面张力、乳化液稳定性指数的影响鲜有报道，不同超声波处理条件下，蛋白质性质改变效果不同。另外，原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）是一种新型检测物质结构分析仪器，具有分辨率高、标本制备方便和操作简单等优点，因而Gao Ruichang等[26]应用AFM观察了组氨酸对大头鱼肌球蛋白的热诱导凝胶聚集结构。然而，应用AFM观察超声波处理对肌原纤维结构影响鲜见研究报道。

因此，本实验提取鸡胸肉MP，在低频高强度超声波不同时间处理下，研究MP的Turbiscan稳定性指数（Turbiscan stability index，TSI）、静态流变学性质、溶解性、电位以及结构变化，分析肌原纤维组成变化，探讨超声波对鸡肉MP性质的影响，以期为超声波在乳化型制品中的应用提供理论参考与指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡胸肉购于郑州丹尼斯超市。剔除鸡肉中结缔组织及多余脂肪，然后用真空包装袋分装，每袋200 g，真空包装后储存于-20 ℃，贮藏时间不超过2 周。

大豆油 益海嘉里金龙鱼粮油食品有限公司；乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸 北京华迈科生物技术有限责任公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）上海源叶生物有限公司；牛血清白蛋白（纯度98%）美国Sigma公司；所用试剂纯度均为分析纯及以上。

1.2 仪器与设备

SZ-22A绞肉机 广州旭众食品机械有限公司；T25高速搅拌器 德国IKA公司；VC750超声波破碎仪美国Sonic公司；TU-1810紫外分光光度计 北京通用仪器有限公司；F-7000荧光光度计 日本日立公司；Discovery流变仪 美国TA仪器公司；Nano-ZS90纳米激光粒度仪 英国马尔文仪器公司；凝胶成像仪美国伯乐公司；Chirascan圆二色光谱仪 英国应用光学物理公司；Turbiscan LabMeasuringExpert多重光散射仪 法国Formulaction仪器公司；NanoManVS型原子力显微镜 美国布鲁克公司；K100自动界面张力仪德国Krüss公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

参考Zhao Yingying等[27]的方法提取。将鸡胸肉于4 ℃解冻12 h，切成l～2 cm小块，3 000 r/min绞碎15 s，重复4 次。0～4 ℃条件下提取MP。均匀绞碎的鸡胸肉与分离缓冲液（10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4、0.1 mol/L NaCl、20 mmol/L MgCl2、10 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 7.0）按质量体积比1∶4均匀混合，6 000 r/min转速下均质3 次，每次30 s；混合物用20 目筛网（孔径0.9 mm）过滤后，2 000×g离心15 min，收集沉淀物质，相同的步骤再重复两次，得到MP沉淀。将沉淀物按质量体积比1∶4均匀分散在0.1 mol/L NaCl溶液中，2 000×g离心15 min，重复相同步骤两次，得到纯化的MP。MP质量浓度测定采用双缩脲法，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。MP于4 ℃保存。

1.3.2 低频高强度超声波处理

将上述提取的MP用磷酸盐缓冲液（0.6 mol/L NaCl、20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0，下同）配成质量浓度为10 mg/mL的MP溶液，取70 mL溶液于100 mL的小烧杯中，将烧杯放入超声波破碎室进行超声处理。直径13 mm的超声波探头放入MP溶液液面下25 mm处，超声波参数为：频率20 kHz、功率450 W；工作模式：超声2 s，停止4 s，超声波处理累加时间为0、3 min和6 min。利用冰水浴控制所有样品最终温度低于8 ℃。参考Jambrak等[28]方法测定，超声波强度为（30.26±2.73）W/cm2。

1.3.3 MP乳液TSI的测定

将10 mg/mL MP溶液与大豆油按质量体积比4∶1在烧杯内混合，利用碎冰对烧杯进行降温，在高速搅拌器的作用下进行均质制备乳液，条件为：转速10 000 r/min、均质时间30 s、间隔30 s、均质3 次、温度4 ℃。TSI测定方法参考Wang Keliang等[29]，取20 mL的乳液于专用的玻璃瓶中，置于Turbiscan LABExpert多重光散射仪中进行稳定性分析测试。每隔30 s扫描一次，扫描时间30 min、温度25 ℃。利用Turbiscan软件处理可得出样品的TSI。

1.3.4 界面张力的测定

参考O’Sullivan等[3]的方法，稍加修改。采用铂金平板法测定水相（质量分数0.1% MP溶液）和油相（大豆油）之间的界面张力。将装有20 g水相的玻璃皿放入仪器中，使铂金板浸入20 g水相中至3 mm的深度。然后在水相上移入50 g油，在水相和油相之间形成界面。使用K100自动界面张力仪测定界面张力，测试进行2 400 s，整个过程中温度保持在25 ℃。

1.3.5 MP黏度的测定

参考赵颖颖等[30]的方法，并适当修改。采用流变仪测定黏度。取3 mL稀释的蛋白溶液样品均匀涂布于测试平台，用硅胶油密封，防止样品中的水分蒸发。测试参数：测试温度25 ℃、夹缝间隙1 mm、剪切速率1～200 s-1。

1.3.6 MP溶解度、浊度和ζ电位测定

MP的溶解度参考Zhang Ziye等[13]的方法进行测定，用磷酸盐缓冲液将处理后的MP样品质量浓度稀释至1 mg/mL，然后10 000×g、4 ℃下离心20 min，用双缩脲法测定上清液中蛋白质量浓度。溶解度表示为上清液中蛋白质量浓度占样品质量浓度的比例。

浊度测定参考Li Ke等[31]的方法，测定1 mg/mL的MP溶液在350 nm和660 nm波长处的吸光度，以磷酸盐缓冲液为空白。

将处理后的MP溶液用磷酸盐缓冲液稀释至1 mg/mL，用Nano-ZS90型电位/激光粒度仪测定MP的ζ电位。

1.3.7 MP的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）样品配制：配制蛋白质量浓度为2 mg/mL的样液，与上样缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl、体积分数20%甘油、质量分数10% SDS，体积分数10%β-巯基乙醇和质量分数2%溴酚蓝）按体积比1∶1混合，振荡1 min，100 ℃水浴5 min，备用。电泳条件：分离胶质量分数10%，浓缩胶质量分数4%，电泳上样量为10 μL，电泳总时间约2 h，前沿线进入分离胶之间采用电压为60 V，进入分离胶之后电压为110 V至电泳结束。电泳后用染色液（质量分数0.25%考马斯亮蓝R-250、体积分数45.5%乙醇溶液和体积分数9%冰醋酸溶液）染色1 h。然后，用体积分数45.5%乙醇溶液和体积分数9%冰醋酸溶液脱色至背景清晰。最后，用凝胶成像仪进行拍照分析。

1.3.8 MP二级结构测定

MP的二级结构利用圆二色光谱仪测定，参考Zou Ye等[7]方法并适当修改。用磷酸盐缓冲液将MP稀释至0.1 mg/mL，放入1 mm的比色皿中，以磷酸盐缓冲液为对照。扫描范围为260～190 nm，步阶为1 nm，对MP溶液进行扫描。扫描结束后用CDNN软件计算蛋白质的二级结构相对含量，MP平均残基摩尔质量取110 g/mol[32]。

1.3.9 AFM观察

利用NanoManVS AFM进行表观形貌观察。参考李雨枫等[33]的方法并适当修改。用磷酸盐缓冲液将MP样品质量浓度稀释至1 mg/mL，取适量的稀释后的MP滴到云母片上，自然晾干后进行AFM分析。所有高度图像使用Nanoscope分析软件进行“平滑”处理。

1.4 数理处理与分析

本实验重复3 次，结果表示为平均值±标准差。采用Origin 8.5软件作图。用SPSS v.21.0软件进行统计分析，使用单因素方差分析法对数据进行分析，采用Duncan’s方法作多重比较，P＜0.05时认为不同处理组间存在显著差异。

2 结果与分析

2.1 MP的TSI分析结果

图1 低频高强度超声波处理MP对其乳液TSI的影响Fig.1 Effect of ultrasonic treatment time on the TSI of MP-stabilized emulsions

TSI是由Turbiscan LabExpert计算得出的统计因子，其表示在给定的时间内体系中所有失稳过程的总和，主要通过汇总乳析、絮凝和/或聚结等变化情况来反映乳化液的动态不稳定性[34]。TSI和稳定性成反比，即TSI越高，样品越不稳定。MP经过不同超声波时间处理后形成乳液的TSI如图1所示。对照组TSI在1 800 s内从0增加到1.24，而经过超声波处理（3 min和6 min）的MP制备乳液TSI分别增加到0.49和0.28，明显低于对照组，表明超声处理可以增加MP乳液的稳定性。超声波处理6 min的TSI最低，这说明超声波处理MP 6 min制备的乳液最稳定。这表明超声波处理能够改善MP的乳化稳定性。这也是因为利用超声“空化效应”产生的机械力作用于MP溶液，使制备乳液油滴分布更加均一[17]，乳液不容易发生相分离和絮凝。

2.2 MP的界面张力分析结果

图2 低频高强度超声波处理MP后对其与大豆油界面张力的影响Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on the interfacial tension of MP-stabilized emulsions

如图2所示，所有MP样品的界面张力随着时间延长而下降，表明MP具有较好的乳化活性，能够吸附油滴，使油-水界面趋于稳定。但是，与对照组相比，经过超声波处理的MP与大豆油之间的界面张力明显降低。尤其是超声波处理MP 6 min组与大豆油之间的界面张力达到最低。O’Sullivan等[3]发现类似结果，超声波处理植物蛋白可以显著降低蛋白溶液与植物油的界面张力。Xiong Wenfei等[35]研究发现高强度超声波处理能够降低卵清蛋白与大豆油之间的界面张力。不同处理组之间界面张力变化的差异，可能与使用的分散相性质和乳化剂类型有关[36]。为降低界面张力，乳化剂必须能够迅速吸附在油-水界面，并进行构象重排，使油滴分散在水相[37]。通过物理或化学手段使MP变性并且链展开，MP表面的活性位点数量增加，使埋藏在蛋白质内部的疏水基团暴露，增加MP的疏水性，因而MP分子能够以更快的速率吸附到油-水界面上，油-水界面接近饱和的单分子层最大吸附量也越多，形成一层致密的富有弹性的界面蛋白膜，从而降低油-水界面张力，提高MP的乳化稳定性[37]。图2结果表明，超声波处理可以有效增强MP的移动性，促进MP在油-水界面形成界面层，使界面张力迅速降低。

2.3 MP的溶解度、浊度和ζ电位分析结果

表1 不同超声波处理时间对MP ζ电位、溶解度和浊度的影响Table 1 Effect of ultrasonic treatment time on the ζ-potential,solubility and turbidity of MP

蛋白质溶解度为在特定的提取条件下，溶解到溶液中的蛋白质量占总蛋白质量的比例，它反映的是蛋白质与水之间的平衡与相互作用。不同超声波处理时间对MP溶解度的影响如表1所示。随着超声波处理时间的不断延长（0～6 min），MP的溶解度显著增加（P＜0.05），由52.22%增加到74.17%。这与Hasnain等[11]的结果相似，超声处理的肌动球蛋白的溶解度随着时间的延长而增加。MP溶解度的增加可能是由于MP溶液暴露在高强度超声波中，超声波产生的“空化效应”以及湍流可能使MP展开，更多的亲水基团暴露到蛋白质的表面，不溶性的蛋白质聚集体破碎，形成更多的可溶性蛋白质聚集物[38]。超声处理MP，提高其溶解度，对乳液的稳定性起重要作用。MP作为乳化剂，具有更好的可溶性，有助于在水相使可溶聚集体分散，形成稳定包埋油滴的保护膜[39]。另外，需要注意的是对照组使用常规高盐溶液溶解，MP的溶解度已达到较高水平。但是在本课题组前期研究中发现未超声处理MP的乳液极易发生分层，这说明超声波处理MP改善其乳化特性，不仅是由于MP的溶解性增强，还需要进一步探究超声处理对MP结构的影响。

表1显示不同时间超声处理MP的浊度变化。浊度用于评估超声处理MP分散体的聚集水平[31]；浊度越高，说明蛋白质聚集程度越高。当超声时间从0 min延长至6 min时，A350nm和A660nm均显著降低（P＜0.05），表明高强度超声波破坏氢键和疏水相互作用，导致大的蛋白质聚集体破碎成小的蛋白质聚集体，这些结果与MP溶解度增加相对应。

ζ电位表示悬浮粒子的近表面电荷量，是蛋白质胶体/乳剂稳定的一个重要参数[6]。较低的ζ电位绝对值导致静电斥力降低，并趋于絮凝或聚集[7]。如表1所示，超声波处理对MP的ζ电位有显著的影响（P＜0.05）。随着超声时间延长到6 min，MP带有更多的负电荷，具有较高的ζ电位绝对值。ζ电位绝对值的增加可能是由于蛋白质的展开和蛋白质三级结构的变化引起的蛋白质表面暴露了更多的带负电荷的氨基酸基团[40]。该结果表明，超声处理增加MP的带电荷量，使蛋白在油滴之间的静电相互作用和空间排斥作用增强，有助于稳定油滴。

2.4 MP的黏度分析结果

图3 不同超声波处理时间对MP黏度的影响Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on the viscosity of MP

如图3所示，在剪切速率范围内，随着剪切速率的增加，所有样品的黏度先迅速下降后缓慢下降，表现为假塑性流体。Chen Xing等[41]也报道了MP具有假塑性。与对照组相比，处理组的黏度发生明显降低，表明随着超声处理时间的延长，黏度逐渐下降，MP的流动性增加。谢亚如等[42]的研究表明高强度超声波处理会降低肌球蛋白的低温自组装程度，使样品的零剪切黏度降低。这是由于超声波处理能够破坏MP结构的完整性，导致MP的粒径减小[6]，流动性增加，表现出比较低的黏度。因此，超声波处理后MP黏度降低，增强其流动性，促进MP吸附油滴。

2.5 MP的SDS-PAGE分析结果

如图4所示，比较未处理的MP，超声波处理没有引起蛋白质电泳图谱的主要蛋白分子条带变化，这表明超声波处理没有改变蛋白分布。此外，在SDS-PAGE中没有观察到聚合，这说明超声波处理后没有形成新的团聚体。电泳结果与Wang Jingyu等[14]的研究报道类似。

图4 不同超声时间处理的MP的SDS-PAGE图谱Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the SDS-PAGE profile of MP

2.6 MP二级结构分析结果

图5 不同超声波时间对MP的CD光谱的影响Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on the CD spectrum of MP

表2 不同超声波处理时间对MP二级结构相对含量的影响Table 2 Effect of ultrasonic treatment time on the secondary structure contents of MP

如图5所示，不同超声波时间处理的MP的CD光谱在208 nm和222 nm附近出现两个负的吸收峰。这两个峰是α-螺旋结构的吸收峰，而且α-螺旋含量与峰强度成正比[43]。随着超声波处理时间的延长，这两个峰的强度开始衰减，说明MP的α-螺旋结构被破坏。利用CDNN软件计算MP的α-螺旋相对含量，如表2所示，与未超声波处理相比，超声波处理6 min的MP中α-螺旋相对含量显著降低（P＜0.05），由22.10%下降到17.70%。除此之外，β-折叠、β-转角和无规卷曲相对含量显著增加（P＜0.05），这可能是α-螺旋结构的破坏转化为其他二级结构。因为α-螺旋结构是由氢键稳定的，上述结果说明超声波处理可以破坏MP的氢键，使MP二级结构由有序结构转变为无序结构，增加MP的延展性，促进乳化活性增强。

2.7 MP的AFM分析结果

AFM的微悬臂一端有一个纳米级探针，当进行样品扫描时，由于样品表面的起伏，探针与样品之间范德华力的不同会引起微悬臂发生弯曲，从而使照射在悬臂的激光束发生偏转，这种信号被光电二极管收集，转换为电信号，从而获得样品的表观形貌。不同超声波处理时间对MP表面形貌的影响如图6所示。可以观察出未经超声波处理的样品具有一束完整线性特征结构的蛋白分子，说明此时的蛋白质结构还保持着高度有序的状态。李雨枫等[33]研究发现水洗提取的MP也具有这种高度有序的状态。经过超声波处理后的样品，蛋白质的结构被破坏，表现为较小粒径的分散颗粒。从三维结构（图6a～c）可以看出蛋白质表面逐渐平坦，高度降低。

图6 不同超声波处理时间的MP的AFM图Fig.6 AFM images of MP subjected to ultrasonic treatment for different durations

同时，从表3中Rpm结果也可以看出超声处理后样品的高度降低。高度降低可能是因为超声处理破坏了蛋白质的α-螺旋结构（表2），使蛋白质变得疏松，高度下降。Huang Liurong等[44]研究了超声辅助酸处理大豆分离蛋白，结果发现使其高度降低的原因可能是超声处理破坏了大豆分离蛋白的亚基结构，当松散的亚基结构进一步解离，粒子的高度就会降低。为了进一步研究MP的表面形貌，利用Nanoscope分析软件分析得出样品的粗糙度，结果见表3。

表3 不同超声波处理时间对MP表面粗糙度的影响Table 3 Effect of ultrasonic treatment time on the surface roughness of MP

表3为不同超声波处理时间下样品粗糙度的结果。与未经超声处理的样品相比，超声波处理后样品的粗糙度均降低，表明超声波处理可以降低样品的表面粗糙度，使样品表面更光滑。MP表面粗糙度降低可能是因为超声的机械作用使MP的结构被破坏，形成较小体积的单体蛋白或低聚体蛋白。Zou Ye等[45]在研究低频超声处理改善鹅胸肉的嫩度过程中，发现肌动球蛋白较大的聚合物碎片塌陷，形成较小的体积。Jin Jian等[46]研究发现超声处理能够降低谷蛋白的高度和表面粗糙度。这些结果表明超声波处理破坏了MP的有序结构，降低了MP的粒度，使粒度更加均一，从而促进与油滴交互作用，降低油-水界面张力，增强乳化特性。

3 结 论

低频高强度超声波（20 kHz、450 W、0 W/cm2）处理MP，会改变蛋白质结构性质。与未经超声处理的样品相比，超声处理可以增加蛋白聚集体的可溶性，增强流动性，提高静电相互作用，降低蛋白聚集程度。随着超声波处理时间的延长（0～6 min），α-螺旋的相对含量显著降低（P＜0.05），β-折叠、β-转角和无规卷曲相对含量显著增加（P＜0.05），MP有序结构遭到破坏，向无序结构转变。同时，AFM结果显示超声波处理破坏了MP的结构，降低其粒度并提高了均一性，因而超声波处理后MP的乳化稳定性指数增加，使蛋白在油-水界面张力迅速降低，有助于MP乳化特性的改善。因此，超声波可以提高MP的乳化特性，这与超声波引起MP结构的改变密切相关。