高通量测序结合捕获技术检测非霍奇金B细胞淋巴瘤中重链基因重排VDJ区的临床研究

马 超，孙 璐，赵 瑜，薄 剑

非霍奇金B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤中最为普遍的一类，临床上具有高度的异质性[1]。这种异质性不仅体现在患者不同的症状表现，更体现在对治疗反应的差异。肿瘤临床异质性本质上是由其生物学异质性决定的，涉及肿瘤细胞之间复杂的克隆进化关系[2]。理解肿瘤异质性是理解肿瘤发生与进展机制的关键，对肿瘤的诊断、预后、监测及治疗也有非常重要的价值[2]。在恶性B淋巴瘤的B淋巴细胞中存在天然的克隆标志物，在抗原刺激下，每个B细胞可以通过连接免疫球蛋白重链基因的一个V(variable)、一个D(diversity)和一个J(joining)片段形成一个独特的VDJ序列，特定的VDJ重排序列可以用来追踪单个B细胞的克隆进化[3]。这些VDJ重排形成了多样性的B细胞受体(B-cell Receptor，BCR)区域，用来识别不同的抗原，其中互补决定区3(CDR3)的序列对BCR的抗原识别贡献最多[4]。

针对B细胞表面受体的V基因和J基因及其保守区域设计多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)引物，通过多重PCR技术扩增B细胞的CDR3区域，再结合新一代高通量测序技术(NGS)，开展CDR3区域的高深度测序和识别，以此获得免疫细胞多样性信息，这一技术被称为针对B细胞的免疫组库测序技术[5]。对IgH重排的深度测序，可获得数百万条具体量化的VDJ序列信息，全面评估免疫细胞的克隆多样性，可用于淋巴瘤的诊断与预后[6]；同时，测序可以得到样本中的特异性寡克隆序列，可将其作为特异性标志物，用于后续微小病灶残留(minimal residual disease，MRD)的检测与复发监测[7-9]。2015年，Oki等[10]利用该技术检测了17例经典霍奇金淋巴瘤组织，并在12例患者组织中找到了淋巴肿瘤特异性寡克隆序列，证实了免疫组库技术对淋巴瘤细胞组织中IgH重排检测的可行性。

此外，Kwok等[11]进行了基于血浆游离DNA(cfDNA)的免疫组库测序，对非霍奇金B细胞淋巴瘤治疗前、治疗中和治疗后的特异性寡克隆细胞进行定量检测。Roschewski等利用免疫组库测序技术实现了对临床非霍奇金淋巴瘤患者的循环肿瘤DNA(ctDNA)的动态监测，证实淋巴瘤的多个肿瘤克隆和亚克隆组成在治疗的选择性压力下，会随着时间的推移不断进化。在基于ctDNA的无创监测中，免疫组库测序技术克服了淋巴瘤组织活检中成像扫描的技术局限性，可在分子水平上实时分析耐药疾病的分子特征。尤其是在针对体细胞突变复发性疾病时，可解决临床遇到的肿瘤时间异质性及克隆进化的问题，还能辅助临床治疗耐药性的机制研究，从而指导精准治疗[12]。因此，本研究尝试在非霍奇金B细胞淋巴瘤中，利用NGS检测患者初诊时的组织与血浆样本中具体量化的CDR3序列信息，评估IgH重排与B细胞克隆的多样性，并分析其与临床病例特征之间的相关性。另外，测序得到的样本中特异性寡克隆序列，有望作为特异性的生物标志物用于后续MRD的检测及复发监测。

1 材料与方法

1.1 病例与样本 收集2019年3月至2020年5月解放军总医院第一医学中心血液科治疗的非霍奇金B细胞淋巴瘤患者15例，包括11例弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)，1例滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)，2例边缘区淋巴瘤(marginal zone B-cell lymphoma，MZBL)，1例边缘区淋巴瘤伴局部弥漫大B转化。病理诊断根据2016年WHO关于淋巴瘤的诊断标准。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。采集所有患者初诊时石蜡切片组织样本和治疗前的外周血样本。石蜡组织切片厚度为4 μm，至少10张切片。外周血样本要求10 mL，EDTA管采集，4 h之内离心分离血浆，保存于-20 ℃冰箱。

1.2 成熟B细胞淋巴瘤患者的临床特征 15例非霍奇金B细胞淋巴瘤患者一般临床特征如表1所示，包含9例女性，6例男性，平均年龄为51岁。本研究组把组织以及血浆中的克隆指数、组织中特异性寡克隆数与Ann Arbor分期、IPI得分、血清LDH水平等各项临床病理指标进行相关性分析，由于样本数限制，尚未发现这些指标与各项临床病理指标存在显著相关性。

表1 患者临床病理特征

1.3 仪器与试剂 本研究中切片样本所用的DNA提取试剂盒为DNeasy Blood &Tissue kit(Qiagen公司,美国)，血浆样本所用的cfDNA提取试剂盒为QIAamp Circulating Nucleic Acid kit(Qiagen公司,美国)基因扩增仪为(ABI公司，美国)，VDJ区域扩增使用VDJ扩增试剂盒(北京MyGenostics公司)，高通量测序仪为Hiseq Novaseq(Illumina，美国)。

1.4 DNA提取 分别根据试剂盒的说明书提取石蜡切片组织样本与血浆样本的cfDNA，-20 ℃冰箱保存。

1.5 VDJ扩增子建库与测序 根据VDJ扩增试剂盒(MyGenostics公司，北京)说明书进行扩增。组织样本初始DNA起始量为1μg，血浆样本初始cfDNA起始量为10 ng以上。通过多重PCR技术扩增VDJ区域，获得抗原受体基因区域；然后将扩增得到的PCR产物纯化后建库，通过MyGenostics公司的二代测序平台Illumina Novaseq测序仪进行测序，读长为两端各150个碱基。每个样本的测序数据量不少于3G，Q30>90%，获得的序列(reads)数>300万。对下机数据进行过滤，去除低质量带接头序列，就得干净序列(clean reads)进行后续比对分析，参考序列来自于国际免疫遗传学数据库(IMGT,http://www.imgt.org/)。根据比对结果，统计V/D/J基因的频率信息，提取CDR区域序列，评估免疫组库的多样性，进行样本间及样本内对比分析和聚类分析，鉴定淋巴瘤特异性寡克隆序列[13]。通过克隆指数(Clonality)分析来评估B细胞克隆的多样性[14]。

1.6 统计分析 应用SPSS 22.0统计软件，利用Spearman相关系数评估相关性，两组间比较采用双尾两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫球蛋白重链基因的VDJ重排 经过质控过滤，一共得到4.9865亿条干净序列，其中3.6492亿条序列可比对到参考基因组上，平均每个组织样本中可比对到参考基因组上的序列为1 068万条序列，每个血浆样本中可比对到参考基因组上的序列为1 364万条序列。因此，可以全面量化检测互补决定区(CDR3)序列。在组织样本中，平均检出11 212条唯一的CDR3序列，范围从515到41 476条；在血浆样本中，平均检出1 689条唯一的CDR3序列，范围从238到6 499条，表2。克隆指数分析结果显示，血浆与组织中的克隆指数没有显著相关性，图1。

表2 测序结果摘要

本研究组在73.3%(11/15)的患者组织中检出特异性寡克隆序列，在其对应的血浆样本中，72.7%(8/11)存在组织中特异性寡克隆序列。比较了存在特异性寡克隆的样本与没有特异性寡克隆的样本的克隆指数，发现存在特异性寡克隆的样本中，克隆指数显著高于没有特异性寡克隆的样本(图1)，表明存在特异性寡克隆的样本的IgH重排多样性较低。

图1 2组克隆能力比较(*P<0.05)

测序结果同时可以得到完整的CDR3序列与比例，以及各个V、D、J基因片段的使用情况，患者中代表性的特异性寡克隆组成如图2所示，每个样本中最主要的特异性寡克隆序列信息如表3所示。比较IgHV基因片段组成，发现V3家族参与IgH重排最多，为7例(63.6%)。另外，比较组织与血浆中的特异性寡克隆检测结果，发现二者的比例具有显著相关性(Spearman rho=0.803,P=0.003)。

表3 确证的患者最特异性基因重排序列

3 讨论

IgH重排是B淋巴细胞分化成熟过程中非常重要的特征性事件,存在于绝大多数B细胞性非霍奇金淋巴瘤中。NGS检测IgH的VDJ片段重排，可以全面量化评估IgH重排与B细胞克隆的多样性，用于B细胞性淋巴瘤的诊断、预后评估及复发监测[6,15]。本研究之前初步探讨了通过NGS检测IgH重排作为非霍奇金淋巴瘤诊断与监测生物标志物的可行性[16]。在本研究中，收集了15例成熟B细胞淋巴瘤初诊时的组织与血浆样本，通过高通量测序检测其IgH重排，结合临床病理治疗探索其临床价值。

这15例患者的组织与血浆样本全部成功测序，每个样本的CDR3区都获得了至少几百万条的测序序列支撑，保证了数据的可靠性。73.3%(11/15)的患者组织中可以检出特异性寡克隆扩增，这与先前的报道一致，其发现在82例非霍奇金淋巴瘤中，64.6%的组织样本存在淋巴瘤特异性IgH重排[17]。在其对应的血浆样本中，72.7%(8/11)存在组织中的特异性寡克隆，并且二者的比例具有显著相关性。这表明淋巴瘤中血浆样本的IgH重排检测有望作为疗效监测的标记物。整体而言，在15例的血浆样本中，8例检测特异性寡克隆，这与先前He等人报道的非霍奇金淋巴瘤血浆样本中的数据(8/14)类似[18]。Sarkozy等[19]报道滤泡性淋巴瘤中74%的血浆样本中检出特异性寡克隆。

另外，本研究发现在存在特异性寡克隆的组织样本中，克隆指数显著高于没有特异性寡克隆的样本，表明存在特异性寡克隆的样本的克隆多样性较低。这种高克隆低多样性特征也符合先前T细胞受体(TCR)研究中的一些报道。Keane等用NGS检测了92例弥漫大B细胞淋巴瘤患者，发现肿瘤组织中TCR多样性明显受限[20]。Liu等[21]检测的6例滤泡性淋巴瘤的TCR，发现肿瘤组织中TCR多样性受限，调节性T细胞表现出高度的寡克隆扩增。BCR这种高克隆低多样性特征，主要是由于特异性寡克隆的高度扩增导致的，可能与患者预后等临床病理特征相关。因此，本研究着重分析了组织以及血浆中的克隆指数、特异性寡克隆数与Ann Arbor分期、IPI得分、血清LDH水平等临床病理指标的相关性。尽管组织中克隆指数与IPI得分有一定的负相关，但是并不显著。之前一些研究也尝试把IgH重排使用的不同V片段与淋巴血液系统肿瘤的预后联合在一起[22-23]。本研究中由于样本数少及生存期等随访数据的缺失，IgH重排与临床病理特征的相关性还有待进一步探索。

NGS检测IgH重排不仅可获得具体量化的VDJ重排组成，同时可以得到完整的CDR3序列，结合cfDNA样本检测，能实现对MRD的无创检测与肿瘤复发监测。相对于其他一些检测MRD的方法，比如PET/CT、流式细胞术、基于PCR的检测方法，基于NGS的IgH重排测序的一个重要优势在于拥有更高的检测灵敏度及更广泛的应用价值[24]。一项研究用基于NGS的IgH重排测序监测DLBCL患者的复发，发现91%的一线治疗后复发患者在临床影像确诊之前都能检出MRD阳性，并且先于影像学确诊的中位时间达到3.5个月[25]。

综上，本研究认为用NGS检测IgH重排可以全面量化评估克隆异质性，为成熟B细胞淋巴瘤的诊断、预后及治疗提供良好的数据支持。