早期不同压力高压氧对中重型颅脑创伤大鼠的神经功能及IL-1β、IL-10和SOD表达的影响

齐亚南，潘树义，郭大志

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是外科急症之一，特别是中重型TBI，病死率高，预后差。TBI的病理生理过程包括原发性脑损伤和继发性脑损伤，其中继发性脑损伤是影响预后的最重要因素，神经炎症和氧化损伤是继发性脑损伤致病的最主要因素。高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)能迅速有效的改善脑组织的缺氧状态，具有减轻脑水肿、减轻炎症、促进神经再生等作用，在TBI的治疗中有广泛应用。因此本实验拟使用PCI3000精确颅脑撞击仪(深圳瑞沃德科技公司)，采用控制性皮质撞击(cortical impact injury,CCI)方法建立中重型TBI大鼠模型，分别给予1.5绝对大气压(atmosphere absolute,ATA)和2.5 ATA高压氧处理，比较两种不同压力高压氧对中重型颅脑创伤大鼠的神经功能及白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-10和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康清洁级成年雄性SD大鼠[北京科宇动物养殖中心，SCXK(京)2006-008]，体质量250～300 g，共计75只分为5组。①TBI组(n=15)：建立TBI模型成功且术后第1天(D1)改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score，mNSS)7～18分；②假手术组(sham组，n=15)：仅将颅骨开窗，不予头部打击；③1.5 ATA组(n=15)：在TBI组的基础上给予1.5 ATA治疗；④2.5 ATA组(n=15)：在TBI组的基础上给予2.5 ATA治疗；(5)空白对照组(n=15)：不给予处理，正常饲养。预实验结果表明sham组与空白对照组各观察指标无显著性差异。

1.2 TBI模型建立 利用PCI3000精确颅脑撞击仪参照CCI方法建立模型[1]。术前大鼠均禁食禁水6～8 h。大鼠用小动物麻醉机(异氟烷)麻醉后，俯卧位将大鼠头颅固定于脑立体定向仪上，调节仪器确保头颅保持水平。备皮消毒后,沿颅顶正中剪开头皮，分离骨膜，暴露颅骨，用脑立体定位仪确定打击位置(前卤后3.5 mm，中线偏左3 mm)，钻约5 mm的骨窗，保持硬脑膜完整。打击深度6 mm，打击速度4 m/s，停留时间500 ms，撞击杆撞击大鼠硬脑膜。完成打击后，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，碘伏消毒伤口。

1.3 高压氧治疗方案 大鼠颅脑创伤模型成功后，高压氧组大鼠分别在术后D1进行1.5 ATA和2.5 ATA高压氧治疗，1/d(每次加压5 min，稳压吸氧60 min，减压5 min)，连续7 d。

1.4 模型评价方法 在术后D1、第3天(D3)、第7天(D7)进行mNSS评分[2]。评判标准：1～6分为轻型颅脑损伤；7～12分为中型颅脑损伤；13～18分为重型颅脑损伤。术后D1选择mNSS评分为7～18分大鼠为中重型TBI模型。

1.5 血清 IL-1β、IL-10、SOD的含量测定 分别在术后D1、D3、D7采集各组大鼠的尾静脉血，采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清IL-1β、IL-10、SOD的含量。

1.6 脑组织 IL-1β、IL-10、SOD的含量测定 分别在术后D1、D3、D7处死各组大鼠，提取损伤侧海马处的脑组织，采用酶联免疫吸附法检测IL-1β、IL-10和SOD。

2 结果

2.1 不同压力高压氧对大鼠mNSS评分的影响 在D1，TBI组、1.5 ATA组和2.5 ATA组mNSS评分均高于sham组(P<0.05)，但3组间差异无统计学意义(P>0.05)；在D3和D7，1.5 ATA组和2.5 ATA组mNSS评分均低于TBI组，差异有统计学意义(P<0.05)，1.5 ATA组和2.5 ATA组mNSS评分比较差异无统计学意义(P>0.05)，图1。

图1 各组大鼠不同时间神经功能缺损评分统计(aP<0.05)

2.2 不同压力高压氧对血清IL-1β、IL-10和SOD含量的影响 在D1，TBI组、1.5 ATA组和2.5 ATA组血清IL-1β含量较sham组均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；在D3和D7，1.5 ATA组和2.5 ATA组IL-1β含量较TBI组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但1.5 ATA与2.5 ATA组比较差异无统计学意义(P>0.05)，图2A。在D1，TBI组、1.5 ATA组和2.5 ATA组血清IL-10含量较sham组均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；在D3和D7，1.5 ATA组和2.5 ATA组IL-10含量较TBI组明显升高(P<0.05)，1.5 ATA组IL-10含量比2.5 ATA组升高更显著，差异有统计学意义(P<0.05)，图2B。在D1和D3，TBI组、1.5 ATA组和2.5 ATA组血清SOD含量与sham组比较差异无统计学意义(P>0.05)；在D7，1.5 ATA组血清SOD含量较TBI组明显升高，1.5 ATA组SOD含量比2.5 ATA组升高更显著，差异有统计学意义(P<0.05)，图2C。

图2 血清IL-1β、IL-10和SOD含量(*P<0.05；**P<0.01)

2.3 不同压力高压氧对脑组织内IL-1β、IL-10和SOD含量的影响 在D1，TBI组、1.5 ATA组和2.5 ATA组脑组织IL-1β含量较sham组均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；在D3和D7，1.5 ATA组和2.5 ATA组IL-1β含量较TBI组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但1.5 ATA与2.5 ATA组比较无统计学意义(P>0.05)，图3A。在D1，TBI组、1.5 ATA组和2.5 ATA组IL-10含量较sham组均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；在D3和D7，1.5 ATA组和2.5 ATA组IL-10含量较TBI组明显升高，1.5 ATA组IL-10含量比2.5 ATA组升高更显著，差异有统计学意义(P<0.05)，图3B。在D1和D3，TBI组、1.5 ATA组和2.5 ATA组SOD含量较sham组无明显区别(P>0.05)；在D7，1.5 ATA组脑组织SOD含量较TBI组明显升高，1.5 ATA组SOD含量比2.5 ATA组升高更显著，差异有统计学意义(P<0.05)，图3C。

图3 脑组织内IL-1β、IL-10、SOD含量(*P<0.05；**P<0.01)

3 讨论

3.1 炎症反应在创伤性脑损伤发生发展中的作用和变化规律 大量临床和基础研究表明，炎症反应和氧化损伤在创伤性脑损伤的发生、发展和预后中起到关键作用[3-4]。IL-1β是一种促炎因子，能够刺激粘附分子的表达，增加白细胞在内皮细胞的粘附，使白细胞聚集在缺血灶周围，从而加重继发性脑损伤及神经细胞凋亡，此外，IL-1β又能激活巨噬细胞和星形细胞，诱导神经细胞凋亡[5]。Ni等[6]证实，TBI大鼠与sham组、假手术组相比较，数小时内脑内IL-1β的含量明显升高。给予骨髓间充质干细胞治疗后，TBI组大鼠的IL-1β含量及mNSS评分均降低。本研究发现，中重型创伤性脑损伤大鼠血清和脑组织IL-1β的含量显著升高，早期高压氧治疗可显著降低IL-1β的含量，提示高压氧可降低促炎因子水平，减轻神经炎症损伤，但高压力与低压力高压氧治疗效果并无显著性差异。

生物体内往往存在“自我平衡”机制，有促炎因子必有抗炎因子。IL-10便是体内抗炎因子的代表，主要来源于单核巨噬细胞和T辅助细胞，通过抑制多种炎症因子的活化和炎症因子的产生而降低炎症反应[7]。Yuan等[8]研究发现，既往收治的颅脑创伤患者在入院48 h内IL-1β、IL-10的含量均明显升高，且有研究发现在大鼠实验中验证得出，颅脑创伤组大鼠IL-1β、IL-10含量均高于sham组。这提示炎症反应和抗炎过程是一对“双生子”，始终贯穿于TBI的发生发展过程中。本研究发现，中重型创伤性脑损伤大鼠血清和脑组织IL-10的含量显著升高，早期高压氧治疗可进一步促进IL-10含量升高，提示高压氧不但具有抗炎作用，还可以增加机体自身抵抗炎症损伤能力。此外，本研究发现低压力高压氧的“抗炎”效果更好。

血清SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是清除自由基的首要物质，能够催化超氧阴离子等自由基发生歧化反应，维持机体内氧自由基的动态平衡[9]。SOD可提高机体抗氧化水平，降低氧化物的含量,减轻脑损伤周围脑组织的氧化应激反应,促进脑损伤的恢复。Chen等[10]研究显示，TBI后6 h氧化应激即可显著增加，大鼠血清中SOD含量先下降、后升高，表明氧化应激反应是TBI脑损伤的重要机制之一。本研究进一步探讨高低两种压力高压氧治疗对氧化损伤的作用效果发现，早期高压氧治疗可显著增加中重型创伤性脑损伤大鼠血清和脑组织中SOD含量升高，且1.5 ATA组大鼠SOD含量比2.5 ATA组升高更显著，提示早期高压氧治疗不仅不会增加氧化损伤，反而具有增加机体抗氧化应激能力，且低压力高压氧效果更优。

3.2 高压氧压力在神经损伤中的作用 大量研究表明高压氧对脑损伤具有积极的治疗作用及效果[11]。但是，尚不清楚哪种高压氧治疗压力更有利于降低神经细胞的炎性反应，更有利于促进脑损伤的恢复。Cui等[12]对现有的动物实验进行Meta分析发现，给予脑损伤大鼠3.0 ATA高压氧治疗与2.0 ATA高压氧治疗，均可减轻脑水肿情况，但并无明显差别。研究发现，给予脑损伤大鼠2.5 ATA、3.0 ATA高压氧治疗后，梗塞面积及血流均明显改善[13-14]。上述研究提示，高压力的高压氧对减轻脑水肿、改善损伤区域血供和氧供效果更好。此外，Harch等[15]发现给予脑损伤大鼠1.5 ATA高压氧治疗后，大鼠在水迷宫实验中学习成绩显著提高。Kusuda等[16]研究发现，给予帕金森病模型大鼠1.3 ATA高压氧治疗后，高压氧组大鼠在旋转木马和平衡木试验中评分均优于对照组。以上文献报道说明，低压力的高压氧治疗在促进神经损伤方面也有着一定的疗效。因此，未来有必要进一步研究高压氧压力在治疗不同类型神经损伤中的作用和机制。

本研究结果发现，早期高低不同压力高压氧治疗均可促进中重型创伤性脑损伤大鼠的神经损伤恢复，减轻神经炎症和氧化损伤，“低压力”高压氧的抗炎和抗氧化的能力优于“高压力”高压氧，从经济性和安全性角度考虑，低压力高压氧在中重型创伤性脑损伤的治疗中更值得临床推广。但是，本研究尚存在以下不足：(1)本实验采用啮齿类动物大鼠作为研究对象，其自身神经损伤修复能力比灵长类(人)强，减少了不同处理组效果的差异性；(2)炎症反应往往发生于创伤性脑损伤的数分钟到数小时内，本研究是比较不同压力高压氧治疗后1 d、3 d和7 d的IL-1β、IL-10、SOD表达情况，其可能不是炎症反应的关键作用时间。将来需要更进一步的动物和临床研究。