食管癌血清标志物的生物信息学筛选及其临床诊断价值验证

田丽贞，韩润焜，田丽如

食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌最常见的组织类型。ESCC是致死率最高的消化道肿瘤及全球死亡率第六高的肿瘤[1]。其单独手术治疗的5年生存率不足20%[2]。早期食管癌病灶局限，临床症状不明显，不易发现。临床表现仅为轻微梗噎感、胸骨后轻度烧灼等非特异性症状。鳞状细胞癌抗原(SCC)，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1)等血清标志物已广泛用于ESCC的筛查，然而单一血清肿瘤标记物检测特异性不高，目前尚无一种特异性、敏感性较好的诊断指标[3]。近年来，随着生物信息学的发展，越来越多的研究利用GEO和TCGA数据库进行数据挖掘，寻找潜在的肿瘤标志物，并发现许多有价值的肿瘤标志物。本研究对GEO数据库上ESCC相关的数据进行分析，寻找差异的指标，并通过在线基因表达谱分析(GEPIA)工具(http://gepia.cancer-pku.cn/)工具验证其在食管癌组织中的表达情况，随后检测其在血清中的含量，探讨其作为食管癌诊断标志物的临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2016年1月—2018年10月中山大学肿瘤医院经病理确诊的ESCC患者109例，纳入标准：①受检前均未接受放、化疗和手术治疗；②无肝、肾、心、肺等严重器质性疾患，无肿瘤家族史。其中男69例，年龄(41～70)58.1岁；女40例，年龄(49～67)59.9岁。收集广州市戒毒管理局医院配对的健康人体检样本110例做为对照组，男70例，年龄(40～70)58.3岁；女40例，年龄(45～70)59.7岁；体检未发现明显异常及无肿瘤家族史。食管癌组和对照组性别、年龄构成比比较无统计学差异(P>0.05，表1)。

表1 临床样本的特征资料

1.2 GEO数据库差异mRNA的筛选 选用“ESCC”和“mRNA”字段在GEO数据库上筛选ESCC数据集，随后选取GEO数据库(GSE38129)进行差异分析，在微阵列数据分析(limma)R包的线性模型中，利用经验bayes(ebayes)方法比较癌和癌旁组织(adjacent normal tissue)之间的表达，提取mRNA，应用benjamini-hochberg错误发现率方法调整原始P值。对于与多个探针相关的基因，将其分配给在其表达谱上变异最显著的探针。选择调整后的P值(adj.P值)<0.05和log2 foldchange>1.5作为候选指标。

1.3 GEPIA差异基因验证 为了验证筛选基因MMP1在食管癌中的表达水平，本研究使用GEPIA对食管癌组织和癌旁组织中差异基因的表达进行比较。MMP1表达差异用箱型图表示。

1.4 血清样本检测 一次性真空采血管抽取空腹静脉血3 mL送检，离心分离血清。

血清CYFRA21-1、CEA测定采用电化学发光法(上海罗氏公司电化学发光仪E602及其配套试剂)，参考范围分别为0.3～3.3 ng/mL、0～5.00 ng/mL。血清SCC测定采用化学发光法(雅培公司化学发光仪I2000及其配套试剂，美国)，参考范围为0～1.5 ng/mL。血清MMP1测定采用武汉华美生物公司生产的血清基质金属蛋白酶(MMP1)ELISA试剂盒。

2 结果

2.1 MMP1在ESCC癌组织和癌旁组织差异表达对GEO数据库(GSE38129)的30例食管癌组织和30例癌旁组织进行mRNA差异分析，共发现108个基因在食管癌组织和癌旁组织表达差异明显(图1)，其中MMP1的差异最为明显(logFC=4.849,P=7.90E-12)。

T：癌组织，N：癌旁组织

2.2 MMP1表达在GEPIA工具的验证 MMP1在182例食管癌组织的表达明显高于286例癌旁组织(P<0.05，图2)。随后182例患者根据MMP1水平的高低分为高水平组(n=91)和低水平组(n=91)，总体生存分析(OS)显示HR=0.82,P=0.4,；疾病无进展生存(DFS)分析HR=0.92,P=0.73(图3)。

图2 MMP1在182例食管癌组织和286例癌旁组织表达情况

A.OS生存曲线图

2.3 食管癌组与对照组CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1浓度的比较 食管癌组患者血清CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1浓度均明显高于对照组(P<0.05，表2)。

表2 食管癌组与对照组CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1浓度的比较

2.4 ESCC不同分期CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1水平比较 CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1四种标志物血清表达水平在早期(Ⅰ～Ⅱ期)患者显著低于晚期(Ⅲ～Ⅳ期)患者，差异均有统计学意义(P<0.01，表3)。

表3 外周血CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1浓度与食管癌临床分期的关系

2.5 ROC曲线分析CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1单独及联合检测在ESCC的诊断效能 对110例正常对照和109例ESCC患者绘制CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1单独的ROC曲线，MMP1的AUC是0.874；CEA,CYFRA21-1和SCC的AUC分别是0.66、0.735和0.788。4项独立指标中MMP1的曲线下面积最大。为了继续提高诊断的精度，本研究将4项指标进行联合，研究联合检测在ESCC的诊断作用。MMP1和SCC联合的诊断效能最佳，高于传统指标CEA,CYFRA21-1和SCC 3者的联合。

表4 在ESCC中单项和联合的诊断效能

3 讨论

食管癌的主要病理类型为腺癌(esophageal adenocarcinomas，EAC)和ESCC两种。ESCC主要分布在亚洲、非洲及南美洲地区，而EAC主要在欧洲较为常见[1]。目前，临床上常用于食管癌诊断及预后的标志物主要是CEA、CYFRA21-1和SCC[4]。CEA是临床常用的广谱肿瘤标志物，其升高可见于胃癌、肺癌、食管癌、结直肠癌、肝癌等。CYFRA21-1是测量其最初作为肺鳞癌的标志物，一般认为其浓度升高见于鳞状细胞肿瘤[5]。CYFRA21-1对ESCC、肺鳞癌、宫颈癌等的诊断具有重要参考价值。有文献报道，CYFRA21-1可应用于食管癌患者放化疗的监测[6-7]。SCC是鳞状细胞抗原，其在食管癌的筛查中具有重要的作用。然而至今尚无一种理想的血清学肿瘤标记物能单独应用于食管癌的诊断及预后判断。

目前，基于系统生物学和网络科学的生物信息学计算方法已经广泛应用于癌症等复杂疾病的差异基因、蛋白、血清标志物等的筛选。生物信息学方法具有便宜、省时，并且可以通过文献挖掘、关联分析和生物信息学功能丰富验证。随着越来越多的生物医学数据的获取和积累，计算方法将为未来的精确医学策略提供越来越强大的支持。本研究通过GEO数据库上ESCC差异基因的分析，筛选出癌组织和癌旁表达差异明显的基因(MMP1)，并采用GEPIA工具对MMP1在TCGA数据库上进行验证。

MMPs是一个锌和钙依赖的蛋白水解酶家族。目前人类已发现超过24个MMPs的膜锚定或分泌形式。它们被分为胶原酶、明胶酶、苦参素、基质溶出素、膜型基质金属蛋白酶等。MMP1是一种胶原酶分泌蛋白，其中关键特性是它们能够切割间质胶原酶和许多其他细胞外基质(ecm)和非ecm分子。MMP1特异性降解成纤维细胞生长因子结合蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2、3、5和转化生长因子β结合蛋白并释放这些蛋白。在肿瘤发生过程中，MMPs通过细胞粘附力的丧失、细胞分裂的解除和细胞凋亡的逃避，介导肿瘤的转移，影响肿瘤的发生和生长。研究显示，MMP1的过表达与多种肿瘤相关，包括乳腺癌、头颈部肿瘤、肺癌和肾癌等[8-12]。近期，Liu等[11]研究显示MMP1的过表达促进食管癌细胞的生长和转移。Chen等[12]的研究也显示联合检测血清中MMP1在食管癌患者中显著升高。

本研究通过GEO数据库上食管癌差异基因的分析，筛选出癌组织和癌旁组织表达差异明显的基因(MMP1)，并采用GEPIA工具进行验证，最后评估血清中MMP1与传统食管癌标志物对ESCC的诊断价值。CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1四种肿瘤指标水平在ESCC患者与正常人以及Ⅰ～Ⅱ与Ⅲ～Ⅳ期的之间有明显差异。ROC分析显示血清MMP1在ESCC的诊断精度优于CEA、CYFRA21-1以及SCC。这与其他研究结果相符，CEA、CYFRA21-1和SCC展现出较低的灵敏度度，而特异性相对较高[4]。与传统指标相比，MMP1显示出更高的灵密度和稍低的特异性。由于单一指标对ESCC的灵敏度较低(CEA、CYFRA21-1、SCCA)，很多研究都强调联合检测[13-14]。在本研究中，MMP1联合CEA(71.55%),CYFRA21-1(81.09%)或者SCC(82.13%)可以在不明显减低特异性的情况下，分别将原有单一指标的灵敏度(CEA：19.00%、CYFRA21-1：40.00%、SCC：30.90%)明显提升。在早期患者中MMP1和SCC联合的灵敏度最高，到达68.80%。因此，本研究中MMP1联合SCC在ESCC诊断中是最优的组合。

本研究不足之处：由于部分患者随访时间不足一年，未对血清MMP1的预后效能进行评价。虽采用GEPIA工具进行预后分析，但由于TCGA数据库仅显示ESCA(食管癌)的数据，并未区分ESCC，后续可对血清MMP的价值进行大样本验证研究。

综上所述，随着食管癌临床分期的提高，血清MMP1水平逐渐升高，提示可能对于判断ESCC的病情分期、进展及肿瘤的恶性程度均有帮助；血清MMP1联合SCC检测的诊断灵敏度和特异性最佳，可为ESCC的诊断提供参考。