特发性膜性肾病患者血清补体H因子、补体H因子相关蛋白1和补体片段C5a表达观察

田哲,刘建华,秦晓松,刘勇

中国医科大学附属盛京医院，沈阳110004

特发性膜性肾病(IMN)是原发性成人肾病综合征的常见病因之一，约占我国成人肾病综合征患者总数的25%左右，且近年发病率有持续升高趋势[1]。IMN的致病机制仍不十分明确，补体系统的过度激活导致足细胞损伤被认为是发病机制的关键环节[2]。在补体系统已知的三种激活途径中，凝集素途径和旁路途经被认为与IMN的发病机制相关。补体H因子(FH)为补体系统旁路途经的主要负向调控因子，可以通过多种方式减弱旁路途经的激活过程。同时补体H因子也具有自身的调节因子：补体H因子相关蛋白1-5，这一类蛋白可以与补体H因子的表面受体竞争性结合，从而干扰H因子对旁路途经的抑制功能，间接调控补体旁路途经的活化[3]。目前关于血清FH、补体H因子相关蛋白1(FHR1)和补体活化的终末产物补体片段C5a在IMN发病中的作用相关报道较少。2018年2月～2019年8月，我们观察了IMN患者血清FH、FHR1和C5a的表达变化，探讨其在IMN发生、发展中可能产生的作用，并总结其与IMN病情之间的关联性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择同期于中国医科大学附属盛京医院-肾脏内科入院的IMN患者98例(IMN组)，纳入标准为首次入院行肾脏穿刺活检证实为IMN，且入院前未接受过治疗；另选择23例在体检中心进行健康检查的健康体检者，作为健康对照组。

IMN患者中男56例、女42例，年龄(49.46±11.51)岁，血Cr 65.60(55.03，77.93)μmol/L、Urea 4.57(3.42，6.05) mmol/L、Cys-C 1.07(0.92，1.25) mg/L、Uric acid (357.01±97.60 )umol/L、肾小球滤过率eGFR[4]103.37 (95.38，112.83)mL/(kg·1.73 m2)、TP(47.25±7.32)g/L、Alb 24.75(20.50，27.45)g/L、PALB(0.25±0.06 )g/L、A/G1.10(0.90，1.20)、ALT 17.50(13.00，23.25)U/L、AST 18.00(15.00，22.25)U/L、TC 7.30(6.21，9.35)mmol/L、TG 2.15(1.55，3.82)mmol/L、RBC4.50(4.10，4.90)×1012/L、Hb(139.62±16.56)g/L ；健康对照组中男14例、女9例，年龄(52.22±10.27)岁，血Cr 73.10(59.60，75.10)μmol/L、Urea 5.23(4.16，6.08)mmol/L、Cys-C 0.80(0.73，0.87) mg/L、Uric acid (327.66±57.68)umol/L、eGFR 100.26 (93.49，107.39)mL/(kg·1.73 m2)、TP(73.73±3.69 )g/L、Alb 46.30(44.40，49.20) g/L、PALB(0.30±0.05 )g/L、A/G1.75(1.54,1.92)、ALT 19.00(15.00，26.00) U/L、AST 20.00(16.00，23.00)U/L、TC 4.86(4.29，5.94)mmol/L 、TG 1.07(0.93，1.38)mmol/L、RBC4.93(4.60，5.32)×1012/L、Hb(155.74±13.98 )g/L。与健康对照组比较，IMN组血清Cys-C、TC和TG水平升高、血HGB、血RBC计数、A/G、PALB、TP和Alb降低(P均<0.05)，其余指标间差异无统计学意义。

将IMN患者分为少量蛋白尿(24 h尿蛋白<3.5 g/d)者和大量蛋白尿(24 h尿蛋白≥3.5 g/d)者，在大量蛋白尿者中，血清Cr、Cys-C、TC、TG水平显著高于少量蛋白尿者，而TP、Alb、A/G显著低于少量蛋白尿者(P均<0.05)。本研究经本院伦理委员会批准，纳入者均知情同意。

1.2 血清FH、FHR1及C5a检测 IMN组于行肾活检术当日采集静脉血，健康对照组于体检当日采集静脉血，采血2 h内对样本进行离心分装，-80 ℃保存备用，避免反复冻融。采用ELISA法检测血清FH、FHR1和C5a。试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司。实验过程严格按照试剂盒说明书进行。重复3次，取平均值。

2 结果

IMN组血清FH、FHR1、C5a分别为0.52(0.40，0.66)、2.53(1.73，3.49)、2.42(1.23，6.36)，对照组分别为0.57(0.39，0.69)、1.07(0.87，1.64)、0.67(0.56，0.96)，与对照组比较，IMN组血清FHR1、C5a升高(P均<0.05)。少量尿蛋白IMN患者血清FH、FHR1、C5a分别为0.55(0.42，0.73)、 1.73(1.17，2.72)、2.14(1.14，5.03) ，大量蛋白尿IMN患者分别为0.50(0.39，0.63)、 2.83(2.01，3.70)、4.61(1.32，6.59)，与少量蛋白尿IMN患者比较，大量蛋白尿IMN患者血清FHR1水平升高(P<0.05)。

IMN患者血清FHR1、C5a与肾功能生化指标(24 h尿蛋白、Cr、Cys-C、Urea、Uric及eGFR)的相关性分析结果为，IMN患者血清FHR1水平与24 h尿蛋白、Cr和Cys-C均呈正相关(r分别为0.492、0.215、0.371；P均<0.05)，与eGFR存在负相关(r=-0.298；P<0.05)。IMN患者血清C5a水平与24 h尿蛋白、Cr和Cys-C肾功能生化指标均呈正相关(r分别为0.366、0.231、0.253；P均<0.05)，与eGFR存在负相关(r=-0.376；P<0.05)。IMN患者血清FHR1水平与C5a水平呈正相关(r=0.342；P<0.05)。

3 讨论

IMN是一种自身免疫性疾病，是成人肾病综合征最为常见的病理类型之一。补体激活一直被认为是IMN发病机制中的关键环节；但到目前为止，补体系统在IMN中的激活依然充满争议，是膜性肾病机制研究中亟待解决的两个主要问题之一[5]。补体系统的激活共有3种途径：经典途径、凝集素途径和旁路途经。目前关于补体系统在IMN中的研究主要集中在凝集素途径和旁路途经上，早期学者们普遍倾向于凝集素途径激活为主，但随着越来越多凝集素途径缺乏症患者发展为IMN的病例被报道[6,7]，显示在缺乏凝集素途径起始物MBL和Ficolin的情况下，依然可以发生IMN的病理改变，继而旁路途经则越来越得到重视。起初科研人员分别在IMN患者的肾小球沉积物中发现了补体B因子、P因子和H因子等旁路途经特有的补体分子的存在[6,8,9]；Yang等[11]发现在IMN患者的外周血中，代表旁路途经激活的补体片段Ba和Bb显著升高，提示补体旁路途经参与了IMN的发病过程。而在Endo等[11]的研究中，IMN患者尿液中FH和膜攻击复合物C5b-9的水平显著升高，且在接受治疗之后的患者随访中，尿液中FH和C5b-9的水平又显著下降。以上结论均支持补体旁路途经在IMN中的激活过程。所以本次实验主要聚焦于旁路途经，选取了补体旁路途经中重要的调控分子-FH，以及对其本身起调控作用的FHR1；同时选取了终末途径活化片段C5a来配合阐述补体H因子及其相关蛋白对IMN可能产生的机制。

FH是补体旁路途经中主要的负向调控因子，可以在液相以及相应细胞的表面起作用，通过3种途径影响旁路途经的激活：①直接与C3b结合阻止C3转化酶的形成；②作为Ⅰ因子的辅助因子降解C3b为无生理功能的iC3b；③加速旁路途经C3转化酶的衰变；而FHR1主要通过2种方式影响H因子对于旁路途经的抑制功能：①干扰FH介导的C3b活化调节功能；②竞争性结合FH的表面配体，作为一种竞争性抑制剂影响FH的功能。FHR和FH之间的相对平衡也影响了补体旁路途经的激活程度。

在本次研究中，我们发现FHR1和C5a在膜性肾病组中的水平显著高于健康对照组，而FH水平与健康对照组之间无统计学差异。FHR1水平在IMN患者中的升高也反映了补体旁路途经的过度激活：FHR1抑制了FH对于旁路途经的抑制能力，间接导致了补体的过度激活；而终末途径活化片段C5a在膜性肾病组中的显著升高也反映了这一过程。在对于FHR1和C5a进一步的相关性分析中，我们也发现FHR1和C5a呈正相关关系，表明FHR1对于补体系统的活化具有调节作用。但是同时我们也发现，FH在IMN组中和健康对照组中没有显著性差异，这一现象与以往研究中补体膜攻击复合物C5b-9在IMN患者血清学中的表达无统计学差异相似[10]。同时有研究[9]表明，FH和C5b-9在IMN患者的病理标本中染色阳性，且在尿液中高表达。所以我们推测造成FH血清学中无统计学差异的原因可能是由于FH在尿液中的丢失所致。当然也有观点认为补体系统在器官局部的激活造成了组织损伤，但可能并未引起整体循环池中的改变[2]。同时我们也注意到，目前关于补体H因子的研究在其它自身免疫性肾病中也存在一定争议，比如在IgA肾病中，Onda等[12,13]研究均显示相较于健康对照组，疾病组血清中FH的水平显著升高；而在Tortajada等[14]研究报告中，FH在两组间则不具有统计学差异；所以针对补体H因子的研究还需要进一步的探索。

在对于FHR1和C5a同肾功能生化指标之间的相关性分析中可以看到，FHR1和C5a均与24 h尿蛋白、Cr和Cys-C呈显著正相关，而与eGFR呈显著负相关。这也印证了补体旁路途经参与IMN发病机制的想法，随着FHR1的高表达，相应的肾脏损伤也越重。同时我们也注意到，FHR1与肾功能生化指标之间的相关性在多种肾脏疾病中也被发现要强于其他补体分子[15]，这可能是由于补体分子或片段在补体激活的过程中产生了一定的消耗，从而对其相关性产生影响。24 h尿蛋白定量作为目前评价IMN病情的常用临床指标，具有一定的延迟性，往往滞后于肾脏损伤的发展；而补体水平的改变则会在发病初期就显示出来，所以我们推测FHR1和C5a可以作为反映IMN病情的早期指标。

综上所述，IMN患者血清FHR1、C5a水平升高，补体旁路途径的活化参与了IMN的发生、发展，且血清FHR1、C5a水平可能与病情有关，血清FHR1和C5a可能成为评价IMN肾脏损伤的有效生物学标志物。