精浆外泌体在精子成熟过程中的调节机制研究进展

杜冠潮，王福，张继伟，张修举，高庆和，郭俊，赵丰，郭军

中国中医科学院西苑医院，北京 100091

中国10%～15%育龄夫妇面临不孕不育的困扰，其中男性因素占不孕不育原因的40%～50%，精子活力减弱、密度降低等精子质量下降是引起男性不育症的主要原因之一[1]。寻找有效的药物载体和治疗靶点，对于因精子质量异常而导致的男性不育症十分重要。外泌体作为一种体液中普遍存在的膜性囊泡，是新发现的细胞间信号传递方式，其通过与靶细胞融合或传递其内载物，参与细胞间通信、免疫应答、肿瘤发展和转移等生理和病理过程，是治疗疾病的理想载体[2]。精浆外泌体(SE)是来源于男性生殖道内附睾、前列腺以及其他附属性腺的胞外囊泡，大量存在于精浆中。SE通过向精子传递影响精子成熟有关的蛋白质、RNA、脂质、离子等调节男性生殖功能，其携带的功能物质能够影响精子的形态、结构和功能，在精子成熟中发挥了媒介作用[3-4]。现就SE在精子成熟过程中的调节机制综述如下。

1 SE通过增强精子活力调节精子成熟

SE携带的物质通过影响精子鞭毛运动、离子浓度、多元醇代谢途径及调节细胞信号通路等途径参与精子活力获得以影响精子成熟。

附睾小体是由附睾产生的SE，小体内的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)转运至精子后，结合于外致密纤维，作用于精子鞭毛上游离的巯基基团，防止二硫键的提前形成，消除结合于精子鞭毛上的Zn2+，从而改变精子活力。EICKHOFF等[5]将来自附睾头部和尾部的精子用不同浓度的重组MIF孵育，发现附睾头部精子的锌含量显著降低50%。同时，培养液中Zn2+的浓度明显增加，而且精子鞭毛上的游离巯基显著增多。此外，附睾小体内的miR-888通过调节SPAG6和SPAG1基因来维持精子鞭毛的蠕动和成熟的精子结构[6-7]。

Ca2+在前列腺、附睾的浓度较高，精子活力易受到内外Ca2+的影响，而较高的胞外Ca2+为胞内钙提供了源泉。BURDEN等[8]报道前列腺小体上的膜联蛋白能够调控Ca2+通道，增加精子内Ca2+水平。精子Ca2+通道的激活依赖于与前列腺小体的融合，前列腺小体携带的CD38和兰尼碱受体(RyR)转移至精子内，刺激产生环腺苷酸二磷酸(cADPR)，控制精子细胞内Ca2+的进出，从而影响精子活力。质膜钙离子ATP酶4是一种Ca2+外排泵，能够调节能影响Ca2+信号通路的激活，并保持精子内Ca2+的稳态[9]。前列腺小体中还含有Mg2+和Zn2+等二价阳离子，对于精子质量的调节发挥重要作用，但具体机制仍有待深入研究[10]。

SE内的醛糖还原酶(AR)、山梨醇脱氢酶(SODH)通过调节多元醇代谢途径参与了精子活力获得，作用机制先是AR利用电子供体NADPH增加葡萄糖向山梨糖醇的转变，然后再由SODH经NAD+作为电子受体把山梨糖醇氧化成果糖，通过调控精子能量的来源，从而改变精子的活力[11-12]。

蛋白质组学研究表明外泌体含有参与细胞信号通路的蛋白质，如Wnt家族。GROSS等[13]发现，外泌体表面携带Wnt蛋白，诱导靶细胞中的Wnt信号活性，进而发挥生物学功能。CHENG等[14]认为，Wnt信号在精子成熟中发挥了作用，而Wnt信号是由SE转运到精子，进而调控Wnt/GSK3信号通路，改善精子活力[15]。文献[16]报道，附睾小体中含有miR-182、miR-24及miR-15b等。研究发现，miR-182和miR-24可靶向调节糖原合成酶激酶3(GSK3)基因表达，而GSK3参与精子细胞中的Toll样受体信号通路、Wnt信号通路以及环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)介导的蛋白质磷酸化通路等多条通路的激酶，GSK3磷酸化可影响精子的运动能力[17-18]。

此外王瑞等[19]发现，前列腺小体能够提高弱精子症患者精子活力，对正常人群精子活力影响不明显，具体作用机制尚需进一步研究。卞玉莹等[20]采用实时荧光定量PCR技术检测SEmiR-202-5p，发现男性不育症患者与正常生育健康男性存在明显差异，且与精子活力密切相关，可能参与了精子成熟的过程。

2 SE通过提高精子抗氧化能力调节精子成熟

活性氧(ROS)是氧的代谢产物，过高浓度的ROS可以诱导细胞的脂类、蛋白和DNA氧化，从而引起一系列的病理变化。精子细胞膜含有多种不饱和脂肪酸，对ROS导致的氧化损伤极敏感。在精子成熟过程中，大部分的细胞质成分会被丢弃，因此精子的抗氧化能力较弱。ROS的氧化损伤导致精子质量下降，影响男性生育力[21]。

附睾提供了大量的酶和非酶抗氧化分子，其功能是保护精子细胞免受氧化损伤。CHABORY等[22]发现，附睾小体内谷胱甘肽过氧化物酶5(GPX5)在精子的抗氧化损伤过程中起关键作用，是有效的抗氧化剂清除剂，可保护精子抵抗氧化损伤，从而保证其完整性。通过对Gpx5-/-雄性小鼠和WT雄性小鼠精子的流式细胞术分析发现，Gpx5缺失的小鼠附睾尾的精子DNA紧密度明显降低，且存在DNA氧化攻击。对小鼠附睾中表达的酶促清除剂的实时PCR分析表明，Gpx5缺失雄性小鼠的附睾尾上皮组织具有抗氧化反应，以应对过量的ROS。

附睾小体富含附睾精子结合蛋白1(ELSPBP1)，对死亡精子有较高的亲和力。SULLIVAN[23]发现，可能在Zn2+存在的条件下，附睾精子结合蛋白1/胆绿素还原酶A(ELSPBP1/BLVRA)的复合物与死亡的精子结合，防止死亡精子产生的ROS对精子的损伤，保护精子抵抗氧化应激。BLVRA利用NADPH作为质子供体降低胆红素中的胆绿素，后者利用ROS再生胆绿素，这个酶循环实际上是一个ROS清除过程。SAEZ等[24]报道，前列腺小体具有抗氧化特性，通过与产生ROS的多形核嗜中性粒细胞(PMN)相互作用，减少ROS的产生，保护精子，提高精子存活率。

3 SE通过稳定精子膜结构调节精子成熟

精子膜是一种细胞外结构，作为一种生理屏障，维持精子的结构。SE中的蛋白质和脂质有助于维持精子正常活动所需要的膜完整性，并直接反映精子损伤的程度。在精子成熟过程中，精子膜完整性也与精子活力和存活高度相关。

SE与精子的融合有稳固精子细胞膜的作用，主要通过影响精子膜上的脂质来实现。前列腺小体携带有大量的胆固醇，且其内胆固醇与磷脂的比值远远高于精子细胞膜，而胆固醇可以降低细胞膜的流动性。CARLINI等[25]发现，在pH5.0的弱酸性环境下，前列腺小体与精子融合后，精子依赖这一现象转移脂质和蛋白质，使精子膜上胆固醇、鞘磷脂等脂质增加，从而改变精子膜的性质。这使得精子膜流动性降低，有利于受精信号的接收。

DU等[26]在实验中将不同浓度的外泌体加入到精子样品中，培育2 d，发现添加外泌体精子质膜完整性明显高于其他样品；培养10 d，发现添加4倍、16倍浓度外泌体的精子仍保持了60%以上质膜完整。研究证实，SE能够维持精子膜完整性，提高总抗氧化能力(T-AOC)活性，降低丙二醛(MDA)含量，增加精子活力，延长有效存活时间。

4 SE通过调控精子受精能力调节精子成熟

SE携带的部分蛋白质还参与了精子受精能力的获得。在基因组所有6种透明质酸酶中，精子黏附分子1(SPAM1)是惟一有功能的透明质酸酶。研究[27]表明，SPAM1这种多功能糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接蛋白在受精过程中可以被GPI锚定在附睾小体上，在精子穿越卵丘和透明带的过程中发挥作用。

GIBBS等[28]发现，在精子获能后，附睾小体携带胶质瘤相关蛋白质1(GLIPR1L1)定位在精子头部的前部区域，同时透明带结合实验表，GLIPR1L1在精子与卵母细胞周围的透明带结合中起作用。研究数据表明，GLIPR1L1与CAP超家族的其他成员和其他一些蛋白质一起参与了精子与卵母细胞复合体的结合。

前列腺小体主要功能是在射精后与精子相互作用并保护精子，使其保持充分的受精能力，为与卵母细胞相遇做好准备。PONS-REJRAJI等[29]发现，前列腺小体影响精子获能信号通路，可刺激获能早期活动，尤其是P110和P80 P-Tyr，显著减弱了IBMX对P110酪氨酸磷酸化的影响。前列腺小体对与获能相关的pHi增加没有影响。当前列腺小体和IBMX同时出现时，[cAMP]i浓度进一步升高。

综上所述，SE通过增强精子活力、提高精子抗氧化能力、稳定精子膜结构、调控精子受精能力等多种机制参与了精子成熟过程。SE携带的大量蛋白、RNA、脂质等功能物质能够与精子相互作用，这些物质可能成为治疗靶点和分子诊断标记，相信通过努力研究，SE的成分和功能将会得到更多的发掘，为男性生殖系统疾病的诊疗开启新途径。