SERPINE1在结直肠癌中的表达及其预后意义

马靖宇，朱玉峰，白 光

(锦州医科大学附属第一医院普外科，辽宁 锦州 121000)

结直肠癌已成为近几十年来最常见的癌症之一。它已成为全球第四大致命癌症。由于生活方式和饮食行为的变化，结直肠癌的发病率在中国迅速增长，2012年全世界诊断出大肠癌136万例，中国确诊25.3万例(占18.6%)，中国是世界上结直肠癌新病例最多的国家，大肠癌已成为中国居民健康的严重威胁[1]。手术是非转移性结直肠癌患者的主要治疗方法。尽管治疗取得了重大进展，但结直肠癌的病死率仍然很高，并且有40%～50%的患者最终因疾病而死亡[2]。结直肠癌的早期诊断尤为重要。但是，由于早期结直肠癌患者缺乏特定症状，而且大多数地区尚未完成对结直肠癌的筛查，因此很难及早诊断。发现时超过60%的结直肠癌病例已经发展到晚期，且大多已转移，存活率为8%～9%[3]。因此，开发无创且准确的筛查工具以促进结直肠癌的早期检测和精确分期非常重要。迄今为止，基因组学的生物标志物被认为是一种有前途的方法，可以发现潜在的生物标志物来监测肿瘤的发生、发展和预后，从而进一步确保所有患者都得到适当的治疗。这项研究利用生物信息学分析确定了一个具有潜在临床应用价值的靶基因，结合组织芯片和免疫组化技术，比较靶基因在结直肠癌组织和正常结直肠组织中的表达情况，并评估靶基因在结直肠癌患者中的预后意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究共选取了2015年1月1日—2019年1月31日期间在锦州医科大学附属一院普外科因原发性结直肠癌接受手术治疗的230例病例的结直肠癌组织和相邻的癌旁组织。所有患者术前未接受化疗和/或放疗，术后生存超过30 d，且癌症是直接的死亡原因，均接受了门诊或电话随访，可获得完整的随访数据。中位随访时间为735.5 d。根据第七版AJCC TNM分期系统对肿瘤分期进行分类。该研究得到了锦州医科大学伦理委员会的批准且所有患者均签署了知情同意书。使用福尔马林固定石蜡包埋的组织切片的供体组织块制备人结直肠癌组织微阵列。

1.2方法

1.2.1GEO数据集的选择 选择GEO数据库中的四个数据集(GSE113513，GSE32323，GSE75548和GSE25071)合并了134个样本的数据，并进行分析识别出总共89个差异表达基因(DEGs)(|logFold2 change|≥ 1且P<0.05)。本研究数据的筛选条件如下：①以人类与结直肠癌作为关键词；②数据集为全基因组RNA表达谱数据；③仅包括结直肠癌组织和配对的癌旁组织的全基因组微阵列，并且样本量均>10。④基因组微阵列仅使用细胞系，并分析了不同的组织学亚型，但不包括非癌性组织。

1.2.2生物信息学分析 蛋白互相作用(protein-protein interaction,PPI)网络分析是使用检索相互作用基因的搜索工具(STRING)进行的，并根据官方指南通过Cytoscape软件进行可视化[4]。使用Oncolnc工具在线评估候选基因的表达与结直肠癌预后之间的相关性。从癌基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中获得结直肠癌患者的临床资料并通过基因表达增强交互式分析(GEPIA)确定验证靶基因的表达水平。使用GSEA工具在基因本体论的生物学过程中进行了富集分析，选取靶基因显著相关通路，以阐明靶基因表达对结直肠癌生物学途径和过程的影响[5]。纳入标准为P<0.05和FDR q<0.05。

1.2.3模具蜡块的制作 在模具蜡块上打出间距为0.1 mm，直径为0.6 mm的小孔，样本蜡块根据HE染色观察选定并分别在HE染色切片和相应石蜡组织块标记取样组织位点，用内径0.6 mm的不锈钢针进行穿刺，深度为2～3 mm，然后将其固定于模具蜡块的小孔内，将模具蜡块以4 μm厚度切片敷贴于载玻片上，制成组织微阵列。制备好的组织微阵列用于后续的免疫组织化学分析。

1.2.4免疫组织化学 免疫组织化学染色根据制造商提供的方法用含有10%正常血清和1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的三乙醇胺缓冲盐水溶液(tris buffered saline,TBS)溶液封闭2 h后，将组织微阵列与SERPINE1一抗(1∶200稀释，ab125687，Abcam，中国)在4℃孵育过夜，并进行第二次标记，抗体在室温下放置1 h。液体DAB底物在室温下染色10 min。在显微镜下观察标记细胞的信号，并由两名对研究的临床病理因素不知情的独立研究人员进行评估。根据视觉免疫反应评分(immunoreacetive，IRS)=染色强度(IS)乘以阳性面积(AP)来判断结果。IS分为：0(负)，1(弱)，2(中)和3(强)。AP取决于阳性细胞的百分比：0(0)，1(<1/3)，2(1/3～2/3)，3(≥2/3)。IRS 0～1为“-”，IRS 2～3为“ +”，IRS 4～6为“ ++”，IRS 6～9为“ +++”。因此，SERPINE1的表达分为两类：高水平(IRS 4～9)和低水平(IRS 0～3)。

1.3统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件分析数据。通过Pearson卡方检验评估SERPINE1的表达与临床病理参数之间的相关性。使用Cox风险回归模型通过单因素和多因素分析评估SERPINE1的表达在结直肠癌中的预后价值。通过Kaplan-Meier方法估计存活率，并通过对数秩检验进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1结直肠癌的生物信息学分析 在GEO数据库中选择了四个合格数据集GSE113513，GSE32323，GSE75548和GSE25071，并在重叠部分中鉴定了89个差异表达基因，见图1。使用STRING在线数据库分析DEGs的PPI网络，识别结直肠癌进展中的关键基因及其相互作用，并使用Cytoscape软件将其可视化，该网络包含106个节点和466个边缘，见图2。选择MOCE插件来完成PPI网络的k核分析并将k-core阈值设置为2，总共获得了A、B和C三个模块，它们的节点数分别为15、16和9。在这三个模块中，节点度最高的五个基因是CCNB1、RFC2、EXOSC5、P2RY14和SERPINE1。为了研究这五个候选基因是否与结直肠癌患者的生存相关，使用Oncolnc工具在线分析了来自TCGA数据库的结直肠癌患者的基因表达数据和临床数据。根据Kaplan-Meier生存分析，见图3，高CCNB1水平与更好的总体生存率显著相关(logrankP=0.013 7)，而低SERPINE1水平与更好的总体生存率显著相关(logrankP=0.032 5)，表明CCNB1和SERPINE1表达可能与结直肠癌的进展有关。但是在RFC2、EXOSC5和P2RY14中没有发现类似的结果。选择癌基因数据库分析发现在结直肠癌组织中SERPINE1的表达增加，见图4。使用TCGA进行了基因集富集分析(GSEA)鉴定SERPINE1基因的潜在功能。在GSEA分析中，与癌症相关的信号通路包括通过核转录因子κB的肿瘤坏死因子α信号(NES=1.84)和WNT BETA CATENIN信号(NES=1.84)在 SERPINE1的高表达水平样本中最常见(P<0.05，FDR q<0.05)，并且SERPINE1表达较高的样本中血管生成(NES=1.94)和炎症反应(NES=2.10)的基因特征比SERPINE1表达较低的样本更活跃(P<0.05，FDR q<0.05)，见图5。这表明SERPINE1可能通过参与结直肠癌患者的几种癌症相关信号通路来促进疾病进展。

图1 差异表达基因的维恩图

图2 DEGs的PPI网络分析

Figure 3 Draw the overall survival map of candidate genes from Oncolnc database

图4 SERPINE1在大肠癌和正常组织中的表达差异

图5 基因集富集分析

2.2SERPINE1基因在结直肠癌中高表达 应用免疫组织化学技术分析了包括230例大肠癌组织在内的组织芯片来研究SERPINE1在结直肠癌中的表达。SERPINE1的阳性染色主要分布在结直肠癌组织的细胞质中。在结直肠癌组织和正常组织中SERPINE1的代表性免疫组织化学染色。免疫组织化学结果显示，在230例大肠癌中，有134个(58.3%)结直肠癌组织中SERPINE1的表达较高，而其他96例(41.7%)则较低。统计分析表明，SERPINE1蛋白在结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织。见图6。

图6 在结直肠癌样品和相应正常组织中SERPINE1表达的代表性免疫组织化学图像(免疫酶标法 ×200)

2.3结直肠癌SERPINE1表达与临床病理参数的关系 SERPINE1的表达在不同浸润深度、有无淋巴结转移、有无远处转移和不同TNM分期组间差异有统计学意义(P<0.05)。在性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、分化和组织学类型上差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 结直肠癌患者SERPINE1表达与临床参数的相关性

2.4SERPINE1的高表达预示结直肠癌患者的预后不良 以大肠癌患者预后为因变量，以SERPINE1表达、性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度、组织学类型、T分期、N分期、M分期、TNM分期为自变量，采用单因素分析，结果显示浸润深度(P=0.035)，淋巴结转移(P=0.001)，远处转移(P=0.015)，TNM分期(P=0.001)和SERPINE1表达(P=0.002)对整体生存有重大影响，见表2，3。以大肠癌患者预后为因变量，以SERPINE1表达、T分期、N分期、M分期、TNM分期为自变量，采用多因素分析，结果显示SERPINE1表达是结直肠癌患者的独立预后因素(P=0.020)，见表2，4。通过Kaplan-Meier生存分析评估总体生存率(overall surviva,OS)，并通过对数秩检验进行比较，显示SERPINE1表达高的患者比SERPINE1表达低的患者的OS差(P=0.002)。见图7。

表2 变量赋值表

表3 单因素Cox回归分析结果

表4 多因素Cox回归分析结果

图7 结直肠癌患者不同SERPINE1表达的总体生存分析

3 讨 论

利用生物信息学方法筛选出CCNB1和SERPINE1表达可能与结直肠癌的进展有关。已有研究表明，CCNB1在结直肠癌发展的早期阶段过表达并促进细胞增殖，而且结直肠癌中CCNB1的过表达与淋巴结转移、远处转移、TNM分期和不良生存率呈负相关[6-7]。但尚未发现关于SERPINE1表达在大肠癌中意义的研究。Serpin家族E成员1(SERPINE1)，也称为纤溶酶原激活物抑制剂1。许多研究表明，SERPINE1在各种癌症的多步过程中起着至关重要的作用。此外，有几项基因表达研究已将SERPINE1鉴定为与转移相关的重要基因。Pavon等[8]报道，在头颈癌中，SERPINE1的过表达促进肿瘤细胞迁移和转移扩散，促进血管生成，保护细胞免受Fas/Fas-L介导的细胞凋亡，并与不良预后相关。Liao等[9]证明胃癌组织中SERPINE1明显上调，而且SERPINE1高表达与不良生存相。Wu等[10]报道神经胶质瘤中过表达的SERPINE1诱导了细胞凋亡，SERPINE1的作用可能基于调节p53信号通路。SERPINE1在多种肿瘤中起作用。然而，SERPINE1在大肠癌中的异常表达及其临床意义尚未在大规模临床样品中得到证实。在这项研究中，我们通过生物信息学和免疫组织化学证实了SERPINE1在大肠癌患者中的临床意义。与正常组织相比，SERPINE1在结直肠癌患者中显著上调。另外，SERPINE1的高表达与结直肠癌的浸润深度，淋巴结转移，远处转移和TNM分期显著相关。Kaplan-Meier生存分析表明，SERPINE1高表达的患者比低表达的患者的生存时间明显缩短。Cox多因素分析表明，SERPINE1的高表达是结直肠癌患者预后的独立危险因素。因此，可确定SERPINE1的高表达增加了转移的风险，并且为预后不良的标志。

SERPINE1是尿激酶和组织型纤溶酶原激活剂的关键调节剂。尿激酶纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)系统在肿瘤生长，血管生成，肿瘤细胞入侵，迁移和转移中起主要作用[11]。uPA系统通过激活基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMP)和潜在的生长因子来调节肿瘤血管生成和运动[12]。GSEA分析表明，在SERPINE1高表达的结直肠癌样本中，血管生成尤其显著，这表明SERPINE1基因可能通过调节uPA来调节肿瘤血管生成，从而有助于癌症的发展。在结直肠癌中，β-catenin途径的激活有助于uPA的反式激活[13]。通过多种癌基因的转录激活，WNT/β-catenin途径被认为是癌症的关键调节因子[14]。同时，在此研究中，GSEA分析表明，在SERPINE1高表达的结直肠癌组织中，与Wnt/β-catenin途径相关的基因丰富，这表明SERPINE1可能通过Wnt/β-catenin途径参与结直肠癌的发生发展。

结合免疫组织化学结果和生存分析，推测SERPINE1可能在结直肠癌的侵袭和转移中起重要作用。GSEA分析表明，结直肠癌患者中炎症反应与SERPINE1的高表达密切相关。炎症反应在肿瘤的发生，发展和转移中起关键作用[15]。炎症浸润产生的活性氧被认为是异常增生的原因，活性氧会导致细胞损伤，从而导致癌症[16]。肿瘤浸润的骨髓细胞和淋巴细胞产生炎性细胞因子，例如肿瘤坏死因子，它激活髓样细胞中的核转录因子κB并刺激肿瘤相关的炎症，肿瘤坏死因子激活转化后的结肠上皮细胞中的核转录因子κB信号传导并促进其存活和增殖[17]。同时，在该研究中，GSEA分析表明与核转录因子κB的肿瘤坏死因子α信号相关的基因在高表达SERPINE1的结直肠癌样本中富集。以上所有结果提示SERPINE1可能参与了结直肠癌的发生发展，并可能通过参与肿瘤坏死因子α信号通路和Wnt信号通路而影响结直肠癌的预后。因此，深入研究结直肠癌中SERPINE1和SERPINE1途径之间的关系将有助于结直肠癌的研究。

综上所述，本研究证实了SERPINE1在结直肠癌中的临床意义。免疫组化结果表明，SERPINE1在结直肠癌中表达上调，SERPINE1的高表达与肿瘤的侵袭性，疾病的进展和不良的预后密切相关。生物信息学分析也支持SERPINE1的高表达参与了结直肠癌的发病机制，且预后较差。本研究为SERPINE1用作人类结直肠癌有前景的治疗靶标和新的预后生物标志物提供了重要的新证据。