限食后重饲大鼠躯干脂肪改变对骨密度的影响及机制

王素星，邵伟华，王 娜，吕彩霞

(河北省人民医院老年病二科，河北 石家庄 050051)

限食后重饲，为短期热卡限制后重新开放饮食，可导致能量摄入的波动。不适当限食减肥后饮食反弹、疾病和疾病的康复等均伴随热卡摄取的波动[1]。脂肪组织是人体最大的能量储存库，通过脂肪合成、脂肪动员储存或释放能量,应对进食、运动、饥饿等代谢应激[2]。故饮食改变可影响脂肪组织的代谢，而躯干部因其特殊解剖特点，成为脂肪更易聚集的部位。同时，能量摄入的波动多伴随有体重的改变，进而使骨骼的承重负荷发生变化，极有可能影响骨代谢。近年来随着对脂肪功能研究的深入，有关脂肪组织的不同分布类型对骨密度的作用也被不断发现，认为脂肪分布可独立于全身脂肪含量而对骨发生作用。在短期热卡摄入波动模型上，躯干部位的脂肪改变情况是怎样的，与骨密度关系怎样，值得研究。热卡摄入的质和量是一个可控因素，所以探讨能量波动与疾病之间的关系具有重要意义。双能X线吸收测量法是目前检测体成分与骨密度的最有效的手段[3]，并可对不同部位的脂肪含量进行准确评估，其检测的躯干脂肪含量可作为肥胖的替代表型[4]。因此本研究以限制热卡，进而快速恢复不同饮食模式的成年大鼠为模型，检测躯干体脂含量及全身骨密度，观察营养改变过程中不同膳食模式对躯干脂肪含量及骨密度的影响，以及二者之间的关系。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级SD雄性大鼠40只，体质量(160±20)g，购自河北医科大学科研实验动物饲养中心。实验动物质量合格证号:SCXK(冀)2013-1-003。

1.2研究方法 实验大鼠适应性喂养1周后，随机分为5组，实验周期分为4周和12周。4周组分为正常饮食组(normal control 4 week，NC4)和热卡限制(calorie restriction for 4 weeks,R4)组，12周组分为正常饮食组(normal control 12 week，NC12)、限制饮食后重饲普通饮食组[(refeeding with normal chow，RN)，限食4周+8周正常饮食]、限制饮食后重饲高脂饮食组[(refeeding with high-fat diet,RH)，限食4周+8周高脂饮食]。动物及普通饲料均购自河北医科大学实验动物学部，高脂饲料配制参阅国外配方[5]。所有实验程序均经我院伦理委员会批准。

1.3指标检测

1.3.1体重测量 电子秤称取实验动物每日体重及食物摄入质量(精确至0.1 g)。

1.3.2躯干脂肪含量、躯干脂肪比例与骨密度测定 分别在实验的第4、12周末时，大鼠禁食过夜，精确称量体重，按30 mg/kg腹腔注射戊巴比妥，待动物肌力消失，呼吸平稳，仰卧位将四肢用胶带固定于硬纸板，从鼻尖扫描至尾端，选用美国GE Lunar公司生产的双能X线吸收测量仪行躯干脂肪含量、躯干脂肪与全身脂肪比例及全身骨密度测定。

1.3.3肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)及白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)检测 采用酶联免疫吸附测定试剂盒(Pierce公司)，按试剂盒说明操作。

1.3.4三酰甘油(triglyceride，TG)及游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)检测 TG采用脂蛋白脂肪酶-甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法测定，按说明书操作。FFA测定采用酶联免疫吸附剂测定试剂盒，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.5胰岛素检测 放免法测定血浆胰岛素的浓度，遵照胰岛素放免试剂盒说明书逐步进行。

1.3.6骨转换标志物检测 全自动生化分析仪测定血清碱性磷酸酶水平,严格按照试剂盒说明书运用酶联免疫吸附法测定血清骨钙素浓度,在450 nm波长下测光密度值(OD值),计算血清骨钙素含量。

1.4统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件分析数据，本研究限于同周龄实验大鼠组内比较，计量资料比较分别采用F检验，SNK-q检验和独立样本t检验。符合正态分布的两指标相关分析采用Pearson相关分析，不符合正态分布的两指标相关分析采用Spearman相关分析。使用多元逐步回归分析比较全身骨密度与各个变量之间的关系，同时行共线性检验，排除相关性强的影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1体重比较 5组热卡限制4周后，R4组与NC4组比较，体重显著下降(P<0.01)；重饲后，RN及RH组体重均有不同程度提升，但较NC12仍为低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 5组体重比较

2.2躯干脂肪及骨密度比较 R4组躯干脂肪含量及躯干与全身脂肪比例在热卡限制期与NC4组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但R4组全身骨密度下降明显，与NC4组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。重饲后，躯干脂肪含量及躯干与全身脂肪比例均明显升高(P<0.05)，尤其是以RH组为著，但与RN组差异无统计学意义(P>0.05)。RN组的全身骨密度达到NC12组水平，RH组的全身骨密度仍明显低于NC12组，亦较RN组显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 躯干脂肪和骨密度比较

2.3FFA、TG及血清胰岛素(fasting serum lisulin，FINS)水平比较 R4组TG下降明显，与NC4组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，FINS、FFA变化不明显。重饲后，RN及RH组血清FFA、TG及FINS水平均显著高于NC12组水平(P<0.01)，其中RH组FINS及FFA水平亦较RN组明显升高(P<0.05)。见表3。

表3 血清FFA、TG及FINS水平比较

2.4炎症因子比较 热卡限制使R4组血清TNF-α、IL-6水平明显降低，与NC4组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。开放饮食后，RN及RH组血清TNF-α、IL-6水平较NC12组比较均显著升高(P<0.01)，以RH组升高显著(P<0.05)。见表4。

2.5血清骨转换标志物水平比较 热卡限制使R4组血清碱性磷酸酶、骨钙素水平明显降低，与NC4组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。重饲后，RN及RH组血清碱性磷酸酶、骨钙素水平有所提升，但仍明显低于NC12(P<0.05)。见表5。

表5 血清骨转换标志物水平比较

2.6Pearson′s相关分析 全身骨密度与体重、碱性磷酸酶、骨钙素呈正相关(r=0.662、0.613、0.589，P<0.05)；与躯干脂肪含量、躯干脂肪比例、FISN、FFA、TNF-α、IL-6成负相关(r=-0.818、-0.794、-0.623、-0.649、-0.662、-0.537，P<0.05)。进一步行逐步回归分析显示躯干脂肪含量、躯干脂肪比例是影响全身骨密度的重要因素(r2=0.823，P<0.001)。

3 讨 论

因疾病或其他原因导致机体暂时能量摄入减少，随着不利因素解除，饮食恢复，进而可补充前期能量不足时机体的消耗。故机体能量摄入的波动是一种常见的病理生理现象，这个过程中各系统发生的代谢改变越来越引起人们的关注[6]。研究证实体成分受能量供应及饮食的影响[7]。有研究报道，给予40%～60%热卡限制后，大鼠脂肪组织减少明显[8]。然而本研究显示限食阶段躯干脂肪含量及与全身脂肪比例变化不明显。考虑本研究与其他研究热卡限制程度及时间、饲料成分存在差异等有关。但热卡限制导致骨密度下降明显，这与众多研究结果相一致[9-10]。饮食恢复后，RN及RH组均表现出躯干脂肪堆积的现象，至饮食恢复8周时，躯干脂肪含量及与全身脂肪比例均显著高于NC组，以RH组为著。同时实验结束时，高脂重饲RH组全身体重指数恢复程度较普通饮食重饲RN组为差。两组重饲实验动物在体重尚未完全恢复的情况下，均出现躯干脂肪堆积明显，并伴随全身骨骼密度降低，我们推测在该模型上，躯干部位的脂肪堆积对骨代谢产生了负性影响。

需要注意的是，热卡限制是重饲以正常饮食RN组与正常对照NC组的唯一不同之处，我们考虑热卡限制可能是限食后重饲模型躯干脂肪及骨密度改变的始动因素，这可能与热卡限制激活了能量节约代谢机制密切相关。另外，相对于正常饮食重饲，高脂重饲对机体代谢影响更为明显。我们分析高脂再喂养较正常饮食提供了更多热量，而调节营养底物氧化代谢是机体适应不同生理及营养状况的一种重要机制。有研究显示实验动物在限食期间对脂肪的氧化能力低于碳水化合物[11]。提示营养底物供应模式的转变是导致限食后重饲模型中脂质堆积的重要原因。同时，热卡限制降低了成骨细胞活性和骨形成，损害骨矿化和生物力学[9-10]，重饲以高脂饮食后，高脂饮食本身及更为显著的躯干脂肪堆积进一步加剧了骨破坏，故至实验结束，RH组骨密度恢复程度较RN组为差。

肥胖与骨代谢的关系错综复杂，既往研究表明，超重或肥胖者骨质疏松或骨质疏松性骨折发病风险下降，体重和骨密度呈正相关[12-13]。其原因之一可能为增加的体重加大了对骨骼的重力负荷和机械刺激。然而近年来肥胖与骨密度的关系出现了争议，有研究表明在去除了体重对于骨矿密度的作用后，发现脂肪组织的增加并不能预防骨质疏松,甚至可能产生负性的影响[14]。在本研究中，我们发现重饲后躯干脂肪增多，机体出现高胰岛素血症。有研究报道血胰岛素水平不足是糖尿病患者发生骨质疏松原因之一,外源性补充胰岛素可刺激成骨细胞内骨基质的合成,促进成骨细胞摄取葡萄糖,进而使骨基质和骨密度增加[15]。对此我们考虑对于单纯胰岛素不足，补充胰岛素可促进骨形成，预防骨质疏松，我们的模型存在胰岛素分泌过量甚至胰岛素抵抗[6]，后者可影响1α-肾羟化酶的活性，影响肾脏对钙、磷的调节，钙流失增多,以及继发甲状旁腺激素等激素分泌异常，进而影响骨代谢[16]。另外，我们的结果显示血清游离脂肪酸和甘油三酯水平亦升高明显，后者进一步加重胰岛素抵抗，负面调控骨代谢。

本研究重饲后，血清TNF-α、IL-6水平显著升高。腹部脂肪细胞不仅储存能量，而且分泌大量的细胞因子，TNF-α、IL-6等炎性物质使组织处于一种“慢性炎症”环境中，在这一环境中，RANKL作为肿瘤坏死因子超家族的成员被明显上调，它在破骨细胞前体向破骨细胞的分化中起着关键作用[17]，从而促进骨吸收。需要提出的是，热卡限制期间，炎症因子与骨密度呈相同的变化趋势，我们推测限食期间营养底物供应不足，躯干脂肪含量变化不明显，故炎症因子分泌较少，同时热卡限制导致机体能量优先供应重要脏器，骨生成受抑。

相对于RN组，RH组炎症因子以及FISN、FFA、TG升高趋势更为明显，考虑与RH组躯干部位堆积了更多的脂肪，进而胰岛素抵抗、脂代谢紊乱、炎症因子释放程度较RN组更为显著，故对骨代谢影响更为明显，导致血清碱性磷酸酶、骨钙素水平下降显著，后二者在骨骼发育与重建的过程中起重要作用[18]。

综上所述，限食后重饲可以导致躯干部脂质含量及与全身脂肪比例增加，以高脂饮食重饲为著；热卡限制导致骨密度下降明显，高脂饮食重饲较正常饮食重饲骨密度恢复程度差；躯干脂肪含量及比例增加导致的高胰岛素血症、脂质外溢、炎症因子分泌增多，进而影响骨转换，可能是降低全身骨密度的重要原因。