美洲南瓜枯萎病生防药剂和生防菌株筛选

陆美珍 ，柴改凤 ，方晓丽 ，郭凤清 ，张树武 ，刘 佳 ，徐秉良

（1.甘肃农业大学植物保护学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070）

瓜类枯萎病又称萎蔫病、蔓割病、死秧病，是由尖孢镰刀菌引起的土传病害。自20世纪80年代以来，已分布于世界各产瓜区，成为了世界性瓜类土传病害［1］。一般发病率20%～30%，严重的达到50%～80%，甚至绝产，尤其是连作地发病严重［2］。随着瓜类种植规模的扩大，瓜类枯萎病日趋严重，已成为瓜类生产上最主要的病害之一［3］。美洲南瓜（Cucurbito pepo）别名西葫芦、番瓜，在北方保护地大面积栽培［4］，枯萎病的严重发生已经成为限制美洲南瓜生产的重要因素之一，防治枯萎病已经成为了美洲南瓜生产急需解决的重大问题。

对于瓜类枯萎病的防治，目前主要包括用多菌灵或高锰酸钾溶液浸种，用多菌灵进行苗床消毒，利用棉隆、异氰尿酸、含氯药剂进行土壤消毒等处理方式，能够有效降低土壤中枯萎病菌的基数，减轻病害发生［5］。然而长期使用化学药剂，易造成农药残留和环境污染，不仅危害人畜健康而且易使病菌产生抗药性，防治效果不佳［6］。

植物源杀菌剂因其环保长效、易光解、无残留、对环境污染小等特点进入了人们的视线。其中丁子香酚具有触杀性强、安全环保无残留、速效及持效期长、长期使用无抗药性等优点，成为生产绿色无公害农产品的首选农药。陈莉等［7］的研究发现，丁子香酚在土壤中的半衰期为16.5 h，最低检出浓度为0.003 mg/kg，符合农药残留分析的要求，属易分解农药（T1/230 d），按推荐剂量使用是安全的。郑庆伟［8］和韩景红［9］的研究表明，丁子香酚对防治大田马铃薯晚疫病和番茄灰霉病都具有良好的效果。

近年来，利用微生物来防治瓜类枯萎病取得了较大的进展，已成为防治该病害的重要手段［10］。如王丽丽等［11］从黄瓜根际土壤中分离出拮抗黄瓜枯萎病病菌的拮抗菌株。肖密［12］利用哈茨木霉菌T2-16防治西瓜枯萎病，发现哈茨木霉能有效抑制尖孢镰刀菌的生长，抑制率达到67.21%，室内盆栽防效达到了60.00%。李晶等［13］利用枯草芽胞杆菌B29发酵液浸种和灌根防治黄瓜枯萎病效果显著，防效达84.9%。但目前针对美洲南瓜枯萎病生物防治的相关研究相对较少。

我们对美洲南瓜枯萎病生防药剂及菌株进行了筛选及室内防效测定，以期筛选出防治美洲南瓜枯萎病的高效生防药剂及生防菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试病原菌 美洲南瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）从甘肃省武威市金苹果有限责任公司种质资源试验基地患枯萎病的美洲南瓜中分离得到，由甘肃农业大学植物保护学院植物病理学实验室分离、鉴定并保存。

1.1.2 供试药剂 供试化学药剂为50%多菌灵可湿性粉剂（上海悦联化工有限公司）、供试生防药剂有20%乙蒜素乳油（河南省南阳卧龙农药厂）、5%香芹酚水剂（兰州世创生物科技有限公司）、1.3%苦参碱水剂（恒源伟业生物科技发展有限公司）、0.3%丁子香酚可溶性液剂（南通神雨绿色药业有限公司）。

1.1.3 供试生防菌株 供试生防菌株为生防长枝木霉T6菌株（Trichoderma longibrachiatum CGMCC.No.13183）、多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），均由甘肃农业大学植物保护学院植物病理学实验室分离、保存。

1.1.4 供试培养基 PDA培养基:马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL。PDB培养基:马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL。NA培养基:蛋白胨10 g、牛肉浸膏3 g、氯化钠5 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL。NB培养基:蛋白胨10 g、牛肉浸膏3g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL。

1.2 试验方法

1.2.1 美洲南瓜枯萎病生防药剂筛选 以4种生防药剂和1种化学药剂的推荐浓度为基准，采用对半稀释法将每种药剂稀释为6个浓度梯度。PDA培养基灭菌后冷却至50℃左右，加入配制好的供试药剂稀释液，制成含药培养基，重复4次。以加入同等量无菌水的培养基为对照。将打好的直径0.5 cm的美洲南瓜枯萎病菌菌饼置于培养皿中央，于25℃恒温培养箱中培养6 d，用十字交叉法测量菌落直径，取其平均值并记录，计算相对抑菌率，并拍照记录每种含药培养基中病菌生长情况。

1.2.2 美洲南瓜枯萎病生防菌株筛选 在预试验测定生防菌株对美洲南瓜枯萎病菌抑制效果的基础上，设置4种生防菌株的稀释倍数，每种生防菌株分为6个浓度梯度。取出实验室中保存的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌，在NA培养基划线培养至出现单独菌落备用。使用NB液体培养基制备3种芽孢杆菌菌株的发酵液，摇床培养1 d，将摇好的发酵液在8 000 r/min的条件下离心20 min，将上清液用0.22 μm的细菌过滤器过滤孢子，分别得到枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌的菌株发酵液备用。使用PDB液体培养基制备木霉T6菌株的发酵液，摇菌3 d［14］，同上操作得木霉T6菌株发酵液。PDA培养基灭菌后冷却至50℃左右，加入供试生防菌株的发酵液，倒入培养皿制成含药培养基，重复4次。以加入同等量无菌水的培养基为对照。将打好的0.5 cm美洲南瓜枯萎病菌菌饼置于培养皿中央，置于25℃的恒温培养箱中培养6 d，用十字交叉法测量菌落直径，取其平均值并记录，计算相对抑菌率（计算公式同1.2.1），并拍照记录每种含药培养基中菌落的生长情况。

1.2.3 生防菌株对美洲南瓜枯萎病的室内防效测定 在玻璃培养皿（直径9 cm）中铺3层灭菌滤纸（直径9 cm），用移液器均匀滴加3 mL无菌水于滤纸上，至滤纸浸湿并无多余水。将美洲南瓜的种子用75%酒精浸泡消毒2 min，然后用3%次氯酸钠溶液浸泡消毒5～10 min，无菌水冲洗后均匀摆在铺好的滤纸上，把培养皿放于25℃，16 h光照、8 h黑暗的恒温培养箱中培养约7 d。种子长出长1 cm左右的根后，置于装有灭菌营养土的盆中培养。

待培养至4～5叶苗龄时期后，选取长势一致的美洲南瓜苗，将植株根部从花盆中挖出，用流水将植株根部冲洗干净，用无菌滤纸将水分吸干，用无菌剪刀将植株须根剪掉0.2 cm，造成伤口［15］。采用蘸根法接种［16］，将处理后的植株根部全部浸泡在配制好的美洲南瓜枯萎病菌的孢子悬浮液中（107cfu/mL），浸泡 30 min 后［17］，将接种了病原菌的美洲南瓜苗移栽到装有灭菌土的盆中，观察发病状况。

在植株发病初期，用配制筛选出的具有最佳抑菌效果的菌株发酵液对植株进行灌根处理［18］，以正常生长的健株以及接种病原菌的植株作为对照。所有处理均在温室中进行，7 d后观察发病情况。

2 结果与分析

2.1 不同药剂对美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用

从表1可以看出，4种生防药剂均对美洲南瓜枯萎病菌均有抑制作用，以推荐浓度为基础，稀释倍数越小，药剂的抑菌效果越好。其中1.3%苦参碱水剂、5%香芹酚水剂、20%乙蒜素乳油在对应的最高浓度时抑菌率分别为48.7%、33.8%、15.9%，均未超过50%。0.3%丁子香酚可溶性液剂在250倍浓度下抑菌率高达82.6%，菌落直径只有1.48 cm；稀释1 500倍浓度下抑菌率只有59.0%，菌落直径3.48 cm（图1）。0.3%丁子香酚可溶性液剂250倍液抑菌率为82.6%，与50%多菌灵可湿性粉剂300倍液抑菌率91.20%相比无显著性差异。

2.2 不同生防菌株对美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用

从表2可看出，4种生防菌株对美洲南瓜枯萎病菌均具有抑制作用。多粘芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、木霉T6菌株4种菌株在最高浓度时，对美洲南瓜枯萎病菌的抑制率分别为50.8%、55.4%、63.1%、85.7%，均超过50%。其中5倍木

霉T6菌株发酵液的抑菌效果最佳，高达85.7%（图2），其余3种菌株对美洲南瓜枯萎病菌的抑制效果维持在28.7%～63.1%，不同菌株之间抑制效果存在差异。

表1 不同药剂对美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用

表2 不同生防菌株对美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用

2.3 生防菌株对美洲南瓜枯萎病的室内防效

如图3A所示，对照美洲南瓜苗生长健康，茎秆挺直，叶片舒展；接种病原菌的美洲南瓜苗萎蔫倒伏，茎基部变黄萎缩，叶片皱缩变褐（图3B）。接种病原菌后，用稀释5倍的木霉T6菌株发酵液处理的美洲南瓜苗，叶片渐渐舒展，茎基部变白（图3C），可以看出木霉T6菌株对美洲南瓜枯萎病具有明显防效。

3 结论与讨论

木霉菌可作为防治植物病害理想的生防因子［19］。毕卉等［20］筛选出对黄瓜枯萎病菌抑制效果达80%以上的4株高效木霉菌株，分别是哈茨木霉、绿色木霉、长枝木霉和康氏木霉，对黄瓜枯萎病的防治效果最高可达66.57%，对黄瓜根系和植株的生长起到促进作用。本研究表明，生防木霉T6菌株5倍稀释发酵液对美洲南瓜枯萎病菌的抑制率可达85.7%。

何培青等［21］的研究发现，4 μmol/L 的丁子香酚会使番茄灰葡萄孢菌丝生长畸形，李敏［22］发现天然植物源农药百里香酚会对西瓜枯萎病菌菌丝的生长产生抑制作用。本研究中0.3%丁子香酚可溶性液剂250倍液对美洲南瓜枯萎病菌的抑菌率为82.6%，与50%多菌灵可湿性粉剂300倍液抑菌率相比，无显著性差异。

肖荣凤等［23］使用5%哈茨木霉FJAT-9040生防菌剂和10%哈茨木霉FJAT-9040生防菌剂分别处理苦瓜苗，能显著促进植株根系与藤蔓的增长，并证明该作用是哈茨木霉FJAT-9040菌体成分为主发挥的作用。本研究表明，在用长枝木霉T6菌株发酵液处理发病的美洲南瓜枯萎病苗后，具有明显的防治效果，植株发病情况得到了明显的改善。

本研究表明，稀释5倍的生防木霉T6菌株发酵液对美洲南瓜枯萎病菌具有明显的抑制作用，对美洲南瓜枯萎病亦具有一定的防治效果。0.3%丁子香酚可溶性液剂250倍液对美洲南瓜枯萎病菌的生长具有明显的抑制作用，生产上可以考虑用0.3%丁子香酚可溶性液剂代替50%多菌灵可湿性粉剂用于防治美洲南瓜枯萎病。