祛痰清瘀方通过抑制ERK-LATS-YAP 信号缓解糖尿病大鼠大血管并发症的临床研究

寇鑫晖 赵恒侠 陈军 李惠林

糖尿病大血管病变是发生于主动脉、冠状动脉、脑基底动脉和肾动脉等处的动脉粥样(AS)硬化性疾病,糖尿病显著增加大血管并发症的发生率［1］。正常生理状态下,血管内皮细胞处于静息状态,内皮细胞仅在周围细胞正常凋亡后短暂进入增殖状态；而糖尿病病理状态下,由于血液中ox-LDL 的刺激使得内皮细胞异常活化,并持续进入病理性增殖状态,导致内皮功能紊乱［2］。血管内皮细胞活化和功能紊乱是AS 硬化性疾病的始动因素,过度的内皮细胞增殖是血管重构的一个重要因素［3］。如何抑制血管内皮细胞病理性活化和增殖一直是近年的研究热点。近期多项研究［4］证实,YAP 蛋白在血管内皮细胞活化和增殖方面发挥重要作用。本文通过ox-LDL 刺激HAoEC 构建AS 病理模型,阐述祛痰清瘀方对ox-LDL 诱导HAoEC 活化和增殖的抑制作用及其抑制YAP 活化的潜在机制,并在动物模型中进一步验证疗效,为该方在临床中用于防治糖尿病大血管病变提供更加充分的科学依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 动物 12 周龄雄性SD 大鼠60 只,平均体重(250±20)g,实验操作符合《广东省实验动物管理条例》。

1.1.2 细胞 HAoEC 购于美国Lonza。

1.1.3 药物和试剂 祛痰清瘀方组方：熟地15 g、当归15 g、赤芍10 g、川芎10 g、红花10 g、桃仁9 g、半夏15 g、橘红15 g、白茯苓9 g、甘草4.5 g、地龙10 g,购于本院,制成含生药2 g/ml 的浓缩液。内皮细胞生长培养基(EGM-2)购于美国Lonza；TG、TC、LDL-C、HDL-C 胆固醇试剂盒购于南京建成；CCK8 试剂购于日本同仁；所有抗体购于美国CST。

1.2 方法

1.2.1 动物实验 通过喂饲含蔗糖20%、猪油10%、TC 3%、胆酸盐1%的高脂饲料结合腹腔注射35 mg/kg STZ 建立大鼠糖尿病模型。将大鼠随机分为对照组、模型组、祛痰清瘀方组(2.5 g/kg)、辛伐他汀组(20 mg/kg),各10 只。灌胃给药1 次/d。

1.2.2 含药血清 给予大鼠0.5 g/100 g 药物灌胃7 d。动脉采血制备血清,56 ℃灭活30 min。

1.2.3 细胞实验 以20 mg/L ox-LDL 刺激HAoEC 建立活化增殖模型,分为对照组、ox-LDL 组和ox-LDL+祛痰清瘀方组,各6 只。细胞以3×105/ ml 浓度传代于6 孔板。给药组以培养基+10%含药血清处理。

1.2.4 糖脂含量测定 动物禁食12 h,在尾动脉测定FG。腹主动脉采血制血清,以试剂盒测定血清TG、TC,LDL-C 和HDL-C 的浓度。血管组织以氯仿甲醇(1∶1)提取3 d,提取液吹干,无水乙醇定容,试剂盒测定脂质含量。

1.2.5 Western blot 蛋白定量 裂解液蛋白配平,煮沸变性。以20 μg 蛋白电泳分离,并电转至PVDF 膜。一抗室温孵育2 h,二抗室温孵育1 h,充分漂洗。电化学发光法(ECL)发光定量蛋白。

1.2.6 qPCR 裂解液提取RNA,逆转录制备cDNA。聚合酶链式反应(PCR)定量CTGF、CYR61 和ANKRD1 mRNA 表达量,以GAPDH 为内参,以2-ΔΔCt法计算待测mRNA 在各组中的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用t 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠血糖和血脂水平比较 模型组大鼠血清FG、TG、TC、和LDL-C 水平均显著高于对照组,HDL-C 水平低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)；模型组大鼠血清TG 水平显著高于祛痰清瘀方组,差异有统计学意义(P＜0.05)；模型组大鼠血清TG、TC 和LDL-C 水平均显著高于辛伐他汀组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 四组大鼠血糖和血脂水平比较(,mmol/L)

表1 四组大鼠血糖和血脂水平比较(,mmol/L)

注：与对照组比较,aP＜0.01；与祛痰清瘀方组比较,bP＜0.05；与辛伐他汀组比较,cP＜0.05

2.2 四组大鼠主动脉脂质含量比较 模型组大鼠主动脉TG 和TC 含量均显著高于对照组、祛痰清瘀方组和辛伐他汀组,差异有统计学意义(P＜0.01 或＜0.05)。见表2。

表2 四组大鼠主动脉脂质含量比较(,μmol/g)

表2 四组大鼠主动脉脂质含量比较(,μmol/g)

注：与对照组、祛痰清瘀方组和辛伐他汀组比较,aP＜0.01,bP＜0.05

2.3 四组大鼠内皮YAP 表达水平和ERK1/2 磷酸化水平比较 模型组大鼠主动脉中YAP 的表达水平及ERK1/2 的磷酸化水平均显著高于对照组、祛痰清瘀方组和辛伐他汀组,差异有统计学意义(P＜0.01)。见表3。

表3 四组大鼠内皮YAP 表达水平和ERK1/2 磷酸化水平比较(,对照组倍数)

表3 四组大鼠内皮YAP 表达水平和ERK1/2 磷酸化水平比较(,对照组倍数)

注：与对照组、祛痰清瘀方组和辛伐他汀组比较,aP＜0.01

2.4 五组HAoEC 增殖速率比较 ox-LDL 组增殖速率均高于对照组、祛痰清瘀方组和辛伐他汀组,低于祛痰清瘀方+ERK 过表达组,差异有统计学意义(P＜0.01)。见表4。

表4 五组HAoEC 增殖速率比较(,对照组倍数)

表4 五组HAoEC 增殖速率比较(,对照组倍数)

注：与对照组、祛痰清瘀方组、辛伐他汀组及祛痰清瘀方+ERK 过表达组比较,aP＜0.01

2.5 五组细胞中LATS1/2 和YAP 磷酸化水平比较ox-LDL 组细胞中LATS1/2 和YAP 的磷酸化水平显著低于对照组、祛痰清瘀方组和辛伐他汀组,Erk1/2 的磷酸化比例显著高于对照组、祛痰清瘀方组和辛伐他汀组,差异均有统计学意义(P＜0.01)；祛痰清瘀方+ERK 过表达组LATS1/2 和YAP 的磷酸化水平低于祛痰清瘀方组,差异均有统计学意义(P＜0.01)；各组MST1/2 磷酸化水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1。

2.6 五组细胞中YAP 靶基因CTGF、CYR61 和ANKRD1表达水平比较 ox-LDL 组细胞中YAP 靶基因CTGF、CYR61 和ANKRD1 表达水平显著高于对照组、祛痰清瘀方组和辛伐他汀组,差异均有统计学意义(P＜0.01)；祛痰清瘀方+ERK 过表达组YAP 靶基因CTGF、CYR61和ANKRD1的表达水平显著高于祛痰清瘀方组,差异均有统计学意义(P＜0.01)。见表5。

图1 五组细胞中LATS1/2 和YAP 磷酸化水平比较(n=6)

表5 五组细胞中YAP 靶基因CTGF、CYR61 和ANKRD1 表达水平比较(,对照组倍数)

表5 五组细胞中YAP 靶基因CTGF、CYR61 和ANKRD1 表达水平比较(,对照组倍数)

注：与对照组、祛痰清瘀方组、辛伐他汀组,aP＜0.01；与祛痰清瘀方组比较,aP＜0.01

3 讨论

糖尿病人群AS 硬化性疾病患病率显著高于非糖尿患者群 。大血管病变是糖尿病主要死亡因素［5］。目前临床上主要通过他汀类防治糖尿病大血管病变,疗效确定,但该类药物常引起肝功能异常、肌病,导致部分患者无法坚持治疗［6］。开发能够改善患者生存的新型中药制剂,具有广阔的临床前景。研究显示,桃红四物汤和二陈汤能够改善糖尿病合并AS 硬化性疾病患者的临床指标［7］。复方制剂祛痰清瘀方由桃红四物汤和二陈汤化裁而成,其中,改白芍为赤芍,以加强活血祛瘀之力,同时加入地龙以进一步增强活血祛瘀的功效。

糖尿病造成的脂代谢紊乱显著增加血液中脂质氧化产物的水平。ox-LDL 被细胞表面受体CD36 识别后经过复杂的信号转导过程活化下游信号分子Erk1/2,进一步激活YAP［8］。活化的内皮细胞启动增殖及转化程序导致血管病理性重构［9］。YAP 是一个近年才被鉴定出的AS 硬化性疾病致病基因［3,4］。ox-LDL 激活YAP,引起YAP 发生核转位［10］。YAP 的活性除受制于Hippo 信号外,还能被一些丝裂原信号活化,例如Erk1/2 信号［11］。Erk1/2 通过激活YAP,启动内皮细胞增殖过程。活化的血管内皮细胞诱导单核/巨噬细胞停留于内皮下空间,并在这里吞噬脂质,形成脂质过载的泡沫细胞［12］。

本研究中,课题组观察到ox-LDL 浓度依赖性激活体外培养HAoEC 中的YAP,祛痰清瘀方能够抑制ox-LDL 对YAP 的活化作用,然而在对信号通路的研究中发现,ox-LDL 及祛痰清瘀方并不影响YAP 经典信号转导过程中上游蛋白MST1/2 的活性,提示ox-LDL 及祛痰清瘀方可能通过其他途径影响YAP 活性。课题组接下来检测了可影响YAP 活性的有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号。结果发现ox-LDL 通过丝裂原信号Erk1/2 激活内皮细胞中的YAP 蛋白,祛痰清瘀方则抑制Erk1/2 的活性。为了验证此结果,课题组进一步过表达Erk2 蛋白,发现过表达Erk2 能显著活化YAP,同时抵消祛痰清瘀方抑制YAP 活性的作用。

综上所述,祛痰清瘀方通过干扰丝裂原信号转导蛋白Erk1/2,阻碍YAP 活化,抑制内皮细胞病理性增殖介导的糖尿病大血管病变。