卡波西肉瘤病毒编码的kshv-miR-K12-1-5p靶基因预测及生物信息学分析*

龚海波，张慧，普雄明

830001 乌鲁木齐，新疆维吾尔自治区人民医院 皮肤科(龚海波、普雄明)，临床医学研究中心(张慧)

卡波西肉瘤是一种表现为皮肤多发性皮损的内皮细胞肿瘤。卡波西肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus virus,KSHV)与卡波西肉瘤发病关系的认识始于1994年[1]，Chang以及他的合作者们在艾滋病相关性卡波西肉瘤组织中发现了一种全新的病毒，即人类疱疹病毒-8，随后在其它几种类型的卡波西肉瘤组织中均发现了该病毒，而且其感染率高达90%以上。因此,该病毒被国际病毒协会命名为卡波西肉瘤相关疱疹病毒。KSHV被证实与其它增殖性疾病相关，如多中心Castleman病和原发性渗出性淋巴瘤[2-3]。2010年，KSHV被国际癌症研究机构认定为一类致癌物质[4-5]。目前，KSHV相关性肿瘤研究最多的是卡波西肉瘤。自从上世纪九十年代miRNA被发现以来，在过去的二十多年里出现了众多miRNA在人类肿瘤的发生发展过程中扮演不同角色的研究[6]。KSHV属于疱疹病毒，与其它疱疹病毒一样，均为双链DNA病毒，包含至少90个开放阅读框架。KSHV病毒基因组编码12种miRNA前体，这12种miRNA前体共生成25种miRNA成熟体[7]。KSHV病毒基因组编码的这些miRNAs在卡波西肉瘤相关肿瘤中的发生中扮演什么样的角色一直是近年来研究者关注的热点。本次研究选取这25个成熟miRNA中的kshv-miR-K12-1-5p作为研究对象，采用生物信息学的方法预测其靶基因，并对这些靶基因做进一步的基因本体论 ( Gene Ontology，GO)、信号通路富集分析( Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG)、蛋白互作分析(protein-protein interaction,PPI)等分析，为以后的KSHV研究者提供可以借鉴的研究方向和靶点。

1 材料和方法

1.1 kshv-miR-K12-1-5p 基本信息的查询

在数据库miRbase (http://www.mirbase.org/)查询kshv-miR-K12-1-5p的前体、成熟体等基本信息，在数据库miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)中查询kshv-miR-K12-1-5p已经证实的靶基因等信息。

1.2 kshv-miR-K12-1-5p靶基因的预测

在PubMed上检索kshv-miR-K12-1-5p及其靶基因的文献。因为其他预测工具都需要数据库已经收录这个miRNA的名字才能预测，所以预测kshv-miR-K12-1-5p需要利用序列预测，因此本研究选取miRNA靶基因在线预测工具TargetScanHuman Custom 5.2 (http://www.targetscan.org/vert_50/seedmatch.html)和miRDB(http://mirdb.org/custom.html)采用序列预测。并利用在线韦恩图软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)将这两个软件预测的结果取交集。

1.3 kshv-miR-K12-1-5p靶基因的GO功能注释及KEGG富集分析

DAVID(https://david-d.ncifcrf.gov/)是一个整合的在线生物信息数据分析工具[8]，提供了一套全面的基因和蛋白质的功能注释信息。本次研究中我们用该工具来进行kshv-miR-K12-1-5p靶基因的GO功能注释及KEGG富集分析。P<0.05被认为是差异有统计意义。

1.4 kshv-miR-K12-1-5p靶基因网络构建与模块分析

基因互作检索工具(STRING)[9](版本11.0,https://string-db.org/)，是一个在线的获取蛋白互作信息的工具；Cytoscape软件(版本3.6.1)[10]是一款网络可视化并进行编辑和分析的软件。我们将前面获取的基因列表输入STRING，然后将生成的互作网络信息下载下来输入Cytoscape软件进行网络可视化，并利用Cytoscape的插件MCODE[11]和BiNGO[12]对这个互作网络进行进一步分析。MCODE插件功能是发现蛋白互作网络中联系紧密的区域并进行提取和网络可视化。BiNGO是专门用来分析基因富集的GO条目，并进行网络可视化的生物信息学分析插件。本次研究中我们MCODE插件选取的参数为：MCODE scores>7，node score cut-off=0.2, degree cut-off=2, Max depth=100 和k-score=2；BiNGO插件我们选取校正后P<0.05为差异有统计意义。

2 结 果

2.1 kshv-miR-K12-1-5p基本信息

在数据库miRbase中查询得到其成熟体序列为：3’-AUUACAGGAAACUGGGUGUAAGC-5’。在数据库miRTarBase中查询到的已经验证过的靶基因有2个，分别是：NF-Kappa-B抑制因子α(nuclear factor-kappa-B inhibitor-alpha,NFKBIA)和细胞转录因子MAF。通过PubMed查询到经过验证的靶基因有抑制细胞因子信号转导6(suppressor of cytokine signalling 6,SOCS6)。

2.2 kshv-miR-K12-1-5p靶基因的预测结果

利用序列预测，TargetScan Human Custom预测结果有637个结果，miRDB预测结果有1 102个，两者取交集得到354个结果，其中包括NFKBIA和SOCS6，但MAF不在这354个结果里面(图1)。

图1 TargetScan Human Custom和miRDB预测得到的kshv-miR-K12-1-5p靶基因

2.3 kshv-miR-K12-1-5p靶基因的GO功能注释及KEGG富集分析结果

GO分析结果显示kshv-miR-K12-1-5p的靶基因主要富集在神经元投射发育、调节转录、细胞连接、质膜部分、转录因子的活动、转录调节活性；KEGG结果显示这些靶基因主要富集在Wnt信号通路、幽门螺杆菌感染的上皮细胞信号转导、神经营养因子信号通路、慢性粒细胞白血病、霍乱弧菌感染(表1)。

表1 kshv-miR-K12-1-5靶基因的GO和KEGG通路富集分析

2.4 kshv-miR-K12-1-5p靶基因的蛋白互作网络构建及模块分析结果

靶基因蛋白互作网络构建结果见图2，使用Cytoscape软件进行靶基因网络中最关键模块的获取结果(图3)，这个关键模块共包含8个基因：PPIH、POLR2B、HNRNPU、MAGOHB、DNAJC8、HNRNPC、RBM22、HNRNPA3(表2)。BiNGO 插件分析结果显示，这8个基因的生物学过程主要富集在RNA剪接、mRNA代谢过程、氮化物代谢过程、细胞代谢过程、初级代谢过程、基因表达、基因表达调控、RNA稳定等(图4)。

表2 关键基因的简要介绍

图2 STRING数据库获取的kshv-miR-K12-1-5p靶基因蛋白互作网络

图3 使用Cytoscape 软件MCODE插件获取的靶基因网络中最关键模块

图4 使用Cytoscape 软件 BiNGO 插件获得的最关键基因的富集结果

3 讨 论

目前，研究者们对于KSHV编码的miRNA具体功能大多未知。在本研究中，我们首先在数据库miRTarBase中对kshv-miR-K12-1-5p功能及靶基因的研究进行了全面检索，发现NFKBIA和MAF是已经验证过的靶基因。在2010年Lei等[13]的研究中，kshv-miR-K12-1-5p可以通过靶向IκBα mRNA的3’UTR来实现对IκBα蛋白表达水平的调控，进而调控NF-κ信号通路。有研究证实，KSHV可以通过激活NF-κB信号通路来促进宿主细胞的增殖和血管生成[14]，很有可能kshv-miR-K12-1-5p在这个过程中发挥了作用。另有研究表明，NF-κB信号通路的持续激活是KSHV在原发性渗出性淋巴瘤细胞中潜伏感染的关键[15-16]。所以，kshv-miR-K12-1-5p与靶基因NFKBIA的交互作用可能在上述过程中发挥了潜在的作用。对于kshv-miR-K12-1-5p和MAF的关系，在Hansen等[17]的研究中，荧光素酶报告实验证实kshv-miR-K12-1-5p可以靶向MAF，但在他们的实验中并未观察到MAF表达的降低。他们之间的调控关系，最终需要进一步的研究证实。另外，我们在PubMed检索中发现，Zhang等[18]的研究中kshv-miR-k12-1-5p可以通过靶向抑制细胞因子信号转导6(SOCS6)来实现对SLK细胞株的增殖和转移的影响。

在本次生物信息学分析中，我们得到含有8个关键基因的关键模块，我们对于这8个基因的查询均来源于GeneCards和PubMed数据库。总体来讲，目前对这8个基因在人类疾病中的研究都比较少，其中肽基脯氨酰异构酶H(PPIH)是这个模块中的种子基因，可以催化寡肽中脯氨酸亚胺肽键的顺反异构化，因此可以帮助蛋白质折叠[19]。另有Papasaikas等[20]研究证实肽基脯氨酰异构酶H可以调控可变剪切。RNA聚合酶II亚基B(POLR2B)也是一个编码蛋白的基因，编码RNA聚合酶II的第二大亚基，该亚基是一种依赖DNA的RNA聚合酶，催化DNA转录成mRNA、snRNA和microRNA的前体。不均一核糖核蛋白U(HNRNPU)也是一个编码蛋白的基因，该基因编码与核酸结合的蛋白质家族中的一个成员，编码的蛋白与RNA和DNA都有亲和力，该基因的突变被证实与癫痫性脑病有关[20]。关于外显子连接复合亚基(MAGOHB)的信息较少，GeneCards数据库显示该基因参与mRNA剪接和无意义介导衰变通路。DNAJ热休克蛋白家族(Hsp40)成员C8(DNAJC8)抑制脊髓小脑性共济失调蛋白3抗体(ATXN3)在神经元细胞中的聚合[21]。异质核核糖核蛋白C(HNRNPC)被发现与多种人类肿瘤相关，包括乳腺癌[22-23]、卵巢癌[24]等。RNA结合基序蛋白22(RBM22)编码RNA结合蛋白。所编码的蛋白可能在细胞分裂中发挥作用，并可能参与pre-mRNA的剪接。在Mishra等[25]的研究中,异质核核蛋白A3(HNRNPA3)与一个重要癌症相关基因载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚单位3B(APOBEC3B)存在特异性的相互作用；另有研究发现异质核核蛋白A3与阿尔茨海默病可能有密切关系[26]。

本次研究也有以下几点不足：第一，总体来讲，本次研究纯属生物信息学层面的预测和分析，要想得出更为肯定的结论，还需未来进行细胞生物学和分子生物学层面的验证；第二，在本次研究中的方法学选择上，GO和KEGG富集分析我们采用矫正P值得到的基因较少，于是我们为了放宽阈值采用了原始P值进行分析，可能产生假阳性过高的问题；第三，我们对kshv-miR-K12-1-5p的认识还远远不足，只是利用现有数据库分析得到的结果会相对片面，未来需要更多探索性的工作来补充。

综上所述，本次研究通过利用生物信息学的方法，对KSHV编码的kshv-miR-K12-1-5p靶基因预测和靶基因的联系最紧密的模块进行提取和分析，得到了可能在KSHV相关性肿瘤的发生中起关键作用的8个基因，然而，未来需要进一步对这些基因进行细胞生物学和分子生物学的验证和研究。

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