青牛解毒汤水煎液对小鼠的镇痛抗炎作用观察

唐周一豆，覃骊兰

青牛解毒汤是一首经验方，由壮药黄牛茶加路边青退热汤[1]组成，临床上治疗各种热毒症效果显著，但其作用机制尚不明确。2018年7～10月，我们采用醋酸扭体法观察青牛解毒汤水煎液的镇痛作用，利用二甲苯致小鼠耳廓肿胀、棉球致小鼠肉芽肿以及角叉菜胶致小鼠足趾肿胀法观察其对小鼠急慢性炎症的影响[2]，从而完善对青牛解毒汤药理作用的认知，为其临床应用及产品开发提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Secura225D-1CN型万分之一电子天平(德国赛多利斯)，TGL-16M型离心机(湖南湘仪)。

1.1.2 处方组成 青牛解毒汤由路边青30 g、生石膏30 g(先煎)、黄牛茶15 g、白马骨15 g、茅莓15 g组成。路边青为马鞭草科植物大青的干燥全株，生石膏为硫酸盐类矿物硬石膏族石膏，黄牛茶为藤黄科黄牛木属植物黄牛木的根，白马骨为茜草科植物白马骨或六月雪的全草株，茅梅为蔷薇科悬钩子属茅莓的根茎，均由广西中医药大学韦松基教授鉴定。

1.1.3 药品与试剂 醋酸地塞米松(浙江仙琚制药，生产批号161259)；二甲苯(天津大茂，生产批号1301100027)；拜阿司匹灵(德国拜耳，生产批号H20130192)；角叉菜胶(德国Sigma，生产批号C1013-100G)。

1.1.4 实验动物 SPF级昆明种小鼠，雄性，体质量18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可号SCXK(湘)2016-0002。饲养条件：动物于安静、整洁环境下分笼饲养，室温控制在 25 ℃，相对湿度 55%～65%，塑料笼内以玉米芯作垫料，正常饮食，自由饮水。动物实验均于广西中医药大学动物实验中心进行，并严格根据广西中医药大学实验委员会制定的实验动物操作标准进行操作。

1.2 方法

1.2.1 复方青牛解毒汤的制备 根据人临床剂量对小鼠给药剂量进行等效换算，通过预实验决定分别采用临床剂量的2、4、8倍作为青牛解毒汤的低、中、高剂量，浓度分别为34.125、68.250、136.500 g/kg。路边青、白马骨、黄牛茶、茅莓加10倍(m/V)量的蒸馏水浸泡30 min，生石膏布包后加10倍(m/V)量的蒸馏水先煎30 min后，倒入其余药物浸泡液中；电磁炉煎1 h，得滤液；再次加入8倍量的蒸馏水煎1 h，合并滤液[3]；浓缩并配成浓度分别为34.125、68.250、136.500 g/kg的溶液，置4 ℃冰箱备用。

1.2.2 复方青牛解毒汤镇痛作用观察 采用醋酸扭体实验。取小鼠50只，适应性喂养3 d后随机分成5组各10只。青牛解毒汤低、中、高剂量组分别以34.125、68.250、136.500 g/kg的青牛解毒汤20 mL/kg灌胃，模型组以等体积蒸馏水灌胃，阳性药组以等体积拜阿司匹灵5 mg/kg灌胃，1次/d，连续7 d。末次给药1 h后，按顺序腹腔注射0.6%冰醋酸，观察15 min内小鼠扭体反应(腹前壁紧贴笼底、臀部歪扭、腹部内凹和后肢伸张)次数[4]，并计算抑制率。扭体反应抑制率=(模型组扭体反应次数-给药组扭体反应次数)/模型组扭体反应次数×100%。

1.2.3 复方青牛解毒汤抗急性炎性反应观察 采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验。取小鼠50只，分组及用药干预方法同1.2.2，仅阳性药组以等体积醋酸地塞米松5 mg/kg灌胃。末次给药1 h后，以移液枪将30 μL二甲苯均匀涂布小鼠右耳两面，20 min后脱颈处死；沿耳根将小鼠双耳剪下，叠放整齐；用直径8 mm打孔器制作耳片，精确称重，以右耳减去左耳质量判断肿胀度，计算耳廓肿胀抑制率[5]。耳廓肿胀抑制率=(模型组耳廓肿胀度-给药组耳廓肿胀度)/模型组耳廓肿胀度×100%。

1.2.4 复方青牛解毒汤抗慢性炎性反应观察 采用棉球致小鼠肉芽肿实验。取小鼠50只，分组及用药干预方法同1.2.3。干预前各组小鼠腹腔注射4%水合氯醛0.1 mL/10 g麻醉，于小鼠右侧腋窝下置入高温灭菌的棉球5 mg(100 ℃烘箱干燥12 h至恒重)，缝合，次日干预用药。于第8天，将小鼠脱颈处死，剪开腋下皮肤并取出棉球；将肉芽组织周围的脂肪组织剥净，置于滤纸上；将剥取好的肉芽棉球放入60 ℃烘箱(提前预热)干燥12 h，直至恒重，精密称量[6]。以植入后棉球质量减去植入前棉球质量表示肉芽肿质量，计算肉芽肿形成抑制率。肉芽肿形成抑制率=(模型组肉芽肿质量-给药组肉芽肿质量)/模型组肉芽肿质量×100%。

1.2.5 复方青牛解毒汤抗炎性肿胀作用观察 采用角叉菜胶致小鼠足肿胀实验。

1.2.5.1 小鼠足趾肿胀度测定 取小鼠60只，随机分为6组各10只，青牛解毒汤低、中、高剂量组及模型组、阳性药组用药干预同1.2.3，空白组以等体积蒸馏水灌胃；末次给药4 h后，除空白组外，其余各组均于小鼠右后肢足跖皮下注射1%角叉菜胶50 μL；30 min后脱颈处死小鼠，于踝关节处剪下左右后足，称重；以左右后足质量之差作为足趾肿胀度，并计算足趾肿胀抑制率[7]。足趾肿胀抑制率=(模型组足趾肿胀度-给药组足趾肿胀度)/模型组足趾肿胀度×100%。

1.2.5.2 小鼠足趾肿胀组织中前列腺素E2(PGE2)检测 取各组小鼠右后足底损伤组织，制成10%组织匀浆；4 ℃下以3 500 r/min离心15 min，取上清液，按试剂盒说明步骤测定损伤组织中的PGE2[8]。

2 结果

2.1 青牛解毒汤对醋酸致小鼠扭体反应次数的影响 青牛解毒汤中、高剂量组和阳性药组扭体反应次数分别为(11.1±4.5)、(8.7±4.1)、(2.9±3.9)次，均少于模型组的(18.7±9.5)次(P<0.05或<0.01)；青牛解毒汤低剂量组扭体反应次数为(12.0±6.9)次，与模型组间差异无统计学意义。青牛解毒汤低、中、高剂量组扭体反应抑制率分别为35.83%、40.64%、53.48%，阳性药组为84.49%。

2.2 青牛解毒汤对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 青牛解毒汤低、中、高剂量组和阳性药组耳廓肿胀度分别为(3.8±1.6)、(3.6±2.7)、(3.2±1.7)、(3.5±2.0)mg，均低于模型组的(7.8±4.8)mg(P<0.05或<0.01)；牛解毒汤低、中、高剂量组耳廓肿胀抑制率分别为51.87%、53.88%、59.55%，阳性药组为55.73%。

2.3 青牛解毒汤对棉球致小鼠肉芽肿的影响 青牛解毒汤低、中、高剂量组和阳性药组肉芽肿质量分别为(7.2±1.6)、(7.0±0.9)、(6.9±1.1)、(6.7±1.0)mg，均低于模型组的(10.7±1.6)mg(P均<0.01)；牛解毒汤低、中、高剂量组肉芽肿形成抑制率分别为32.44%、34.27%、35.11%，阳性药组为37.65%。

2.4 青牛解毒汤对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响

2.4.1 各组小鼠足趾肿胀度比较 青牛解毒汤低、中、高剂量组和阳性药组足趾肿胀度分别为(42.8±10.0)、(41.3±7.9)、(33.9±11.2)、(11.7±2.6)mg，均低于模型组的(65.2±18.3)mg、高于空白组的(4.4±1.7)mg，且模型组高于空白组(P均<0.01)；牛解毒汤低、中、高剂量组足趾肿胀度抑制率分别为32.03%、34.30%、46.14%，阳性药组为81.47%。

2.4.2 各组小鼠足趾肿胀组织中PGE2表达比较 青牛解毒汤低、中、高剂量组和阳性药组足趾肿胀组织中PGE2为(135.06±26.14)、(117.94±11.47)、(106.23±10.57)、(127.63±14.31)ng/L，均低于模型组的(143.86±12.92)ng/L(P<0.05或<0.01)；青牛解毒汤低剂量组和模型组高于空白组的(117.12±10.24)mg(P均<0.01)，而青牛解毒汤高剂量组低于空白组(P<0.05)。

3 讨论

炎症是机体在遇到各种刺激时所做的防御反应，通常表现为红、肿、热、痛和功能障碍。在大多数情况下，炎症对于机体是有益的，机体通过炎症反应控制损伤的进一步发生；然而，在某些失控的情况下也会对机体有一定的损害，如对人体自身组织的攻击等。在炎症过程中，一方面，损伤因子可直接或间接损伤组织和细胞;另一方面，机体通过一系列血管反应、液体渗出、白细胞渗出及活化，稀释、中和、杀伤和包围损伤因子，且机体通过实质和间质细胞的再生使受损伤的组织得以修复和愈合。因此，可以说炎症是损伤、抗损伤和修复的统一过程[9]。

黄牛茶[10]为藤黄科黄牛木属植物黄牛木的嫩叶、根或树皮。其根及树皮全年可采，洗净切碎，晒干；叶春夏采集，晾干。黄牛茶作为壮药，主产于广西金秀、平南、桂平、北流、龙州、武鸣、隆安、靖西等地，来源广泛，价格便宜，疗效可靠。其性味一说是“甘淡微苦，凉”，一说是“性平”[11]，归肺、胃与大肠经[12]。研究发现，其叶含黄酮苷、酚类、糖类，根含黄酮苷、酚类、氨基酸[12]。复方青牛解毒汤是一首经验方，由黄牛茶加路边青退热汤[4]所组成，临床上用以治疗各种热毒症效果显著。青牛解毒汤是由路边青、黄牛茶、生石膏、白马骨、茅莓按照2∶1∶2∶1∶1配伍而成，主治热毒内盛所致的发热。方中路边青味苦性寒，为清热毒、通龙路之要药，主治发热；生石膏味甘淡，性寒，长于清热毒、退高热；黄牛茶味甘、微苦，性凉，解暑清热，利湿消滞。三药合用，共奏清热毒、退高热之功，为方中之主药。白马骨味淡、微辣，性微寒，功专清热毒、调火路；茅莓味甘、苦，性凉，善清热毒。二药合用，共助主药发挥清热毒之作用，为方中之佐药。五味药相互配伍，共同发挥清热毒、退高热之功效[13]。

目前，我们对于黄牛茶的研究大部分都停留在其化学成分上，而对由其组成的青牛解毒汤也只是在临床应用上获得认同。本研究采用醋酸扭体法观察青牛解毒汤水煎液的镇痛作用，利用二甲苯致小鼠耳廓肿胀、棉球致小鼠肉芽肿以及角叉菜胶致小鼠足趾肿胀法观察其对小鼠急慢性炎症的影响;结果发现，青牛解毒汤水煎剂可减少扭体反应次数、耳廓肿胀度、棉球肉芽肿形成量、足趾肿胀度，表明青牛解毒汤具有一定的镇痛抗炎作用。PGE2是花生四烯酸环氧合酶的代谢产物，为二十碳不饱和脂肪酸。其作用为扩张血管，增加器官血流量，降低血管外周阻力，降低血压；舒张支气管平滑肌，降低通气阻力，抑制胃酸分泌；同时，还具有免疫抑制和抗炎作用[14]。本实验结果表明，青牛解毒汤对足趾肿胀小鼠炎症组织中的PGE2有显著抑制作用，且抑制作用较阳性药物显著，从而控制角叉菜胶致小鼠足趾肿胀炎症的发生。由此可见，青牛解毒汤具有一定的镇痛抗炎作用，其减轻角叉菜胶所致炎性肿胀与降低PGE2表达有关，可为其临床应用及产品开发提供一定的实验依据。