血清抗体阴性重症肌无力相关自身抗体的研究进展

张国艳， 路 美，钟士江 综述 单煜恒 审校

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种由体液免疫介导、细胞免疫及补体参与的，主要累及神经肌肉接头的神经系统自身免疫性疾病，目前全球约有70万MG患者[1]。以往，对于MG的分型主要基于受累肌群的不同及严重程度的差异，如经典的Osserman分型及美国重症肌无力基金会(Myasthenia Gravis Foundation of America，MGFA)分型[2]。但随着多种MG自身抗体的发现，以免疫学为基础的多维度病因学分型逐渐成为MG诊断与治疗的热点问题。

乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，AChR)是最早发现的，也是MG最常累及的分子靶点。它是一种分布于神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)突触后膜的由α、β、γ及ε4亚单位构成的跨膜糖蛋白[3]。目前，临床中广泛应用的检测AChR抗体的方法包括放射性免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay，RIPA)和酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)。这两种方法都是以人横纹肌肉瘤TE671细胞分泌的游离AchR为靶点来检测患者血清中的AChR抗体，其检测的敏感度、特异度类似。其诊断全身型MG敏感度为79.5%，特异度为96.1%[4]。 而在眼肌型MG中上述检测方法的敏感度不到60%。这一类应用RIPA 及ELISA 检测AChR抗体为阴性的MG称为血清抗体阴性MG(seronegative MG，SNMG)[5]。SNMG是临床工作中难以明确诊断、易与其他疾病混淆的一类MG。值得注意的是，SNMG同AChR抗体阳性的MG相同，都是抗原抗体反应为基础的自身免疫性疾病，这一点早在1994年就已得到证实。现根据SNMG抗体不同将SNMG的不同亚型的研究进展进行综述。

1 肌肉特异性酪氨酸激酶抗体阳性的MG

肌肉特异性酪氨酸激酶(MuSK)是一种表达于骨骼肌细胞膜的单次跨膜糖蛋白。在与低密度脂蛋白受体相关蛋白4(low-density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4)结合后，MuSK胞内段的酪氨酸激酶结构域被激活。激活的MuSK通过与下游的突触AChR相关蛋白(AChR-associated protein of the synapse，Rapsyn)相互作用，从而引起AChR在NMJ突触后膜簇集表达。MuSK自身免疫性抗体以IgG4抗体为主，这种自身抗体通过结合MuSK的胞外段，干扰LRP4-MuSK信号传导通路，从而影响AChR 的簇集表达[6]。进一步研究表明，MuSK抗体相关的MG患者血清中同时存在IgG1型抗体，并能够激活补体引起NMJ突触后膜的破坏，SNMG患者血清中MuSK抗体阳性率可达30%～70%[7]。2003年有学者对78例全身型SNMG患者血清进行MuSK抗体检测，其中MuSK抗体阳性为37例，MuSK抗体阳性的MG患者较抗体阴性者延髓肌易受累且更易发生MG危象[8]。文献[9]对比分析了MuSK抗体阳性MG与AChR抗体阳性的MG的临床特点，发现MuSK抗体阳性的MG患者的肌肉受累更为常见且更易出现MG危象。MuSK抗体阳性MG临床表现的异质性是由抗体的异质性决定的，提示咽喉肌、胸锁乳突肌及呼吸肌等中组肌肉的NMJ突触后膜AChR的簇集表达更依赖于MuSK信号通路的传导[10]。

除了累及肌群不同，MuSK抗体阳性MG在治疗药物及疗效方面也与传统MG不同。研究表明，MuSK抗体阳性的MG患者采用胆碱酯酶抑制药及胸腺切除治疗的效果比MuSK抗体阴性者差[11]。原因可能与MuSK抗体不仅干扰了AChR在NMJ突触后膜的簇集，还影响了乙酰胆碱酯酶相关胶原蛋白胶原链(collagen Q，ColQ)同MuSK胞外段的结合有关。上述研究提示，MuSK抗体阳性的MG是一种免疫学及临床表现异质的独特类型。因此，针对SNMG患者进行MuSK抗体检测对于疾病症状预测及严重程度具有较大意义。在完善AChR抗体的检测及MuSK抗体检测后，仍有一部分患者上述两种抗体均为阴性，这类MG称为血清双阴性MG(double-negative MG，DNMG)[12]。

2 LRP4抗体阳性的MG

LRP4是一种以胞外段为主的含有多种低密度脂蛋白重复序列的单次跨膜蛋白。作为LRP4-MuSK信号传导通路的上游结构，LRP4与聚集蛋白结合后能够激活下游的MuSK，从而促使AChR在NMJ突触后膜上蔟集表达。LRP4抗体以IgG1型抗体为主，其致病作用主要通过补体激活途径破坏NMJ突触后膜LRP4并干扰AChR 的簇集表达。LRP4抗体阳性的MG并不常见，在DNMG患者血清中，LRP4抗体阳性率为10%～13%。但LRP4抗体诊断MG的特异性接近100%，只有10%的肌萎缩侧索硬化的患者血清中LRP4抗体也可为阳性，其机制尚不明确[13]。LRP4抗体阳性的MG患者临床症状较轻，受累肌群以眼肌为主，治疗效果及预后较好。提示除LRP4外，MuSK可能同时存在其他的上游激活途径。

目前，针对LRP4抗体的检测方法以ELISA为主，虽然其检测不如AChR抗体及MuSK抗体检测普及，但也逐渐成为MG患者血清抗体常规检查的项目之一。部分MG患者AChR、MuSK及LRP4抗体均为阴性，称为血清三阴性MG[14]。

3 簇集性AChR抗体阳性的MG

文献[15]研究了74例确诊MG患者的血清，其中20例患者AChR抗体阴性的SNMG，这类患者的临床表现、Osserman不同分型的构成比同AChR抗体阳性的MG患者无显著性差异。鉴于临床表现的一致性，SNMG分子靶点的分布及功能很可能同AChR类似或相同，只不过通过现有检测方法无法检测到。基于这样的假设，Leite等[7]将重组的AChR亚单位及Rapsyn共转染至人胚胎肾(human embryonic kidney，HEK)细胞，从而模拟了AChR在NMJ突触后膜的簇集表达，结果发现SNMG患者的血清中存在与细胞表面簇集表达的AchR特异结合的抗体，即簇集性AChR抗体。同AChR抗体相同，簇集性AChR抗体主要为IgG1型抗体，可以激活补体级联反应，从而导致突触后膜AChR的破坏，引起与AChR阳性MG相同的病理改变及临床表现。Leite等[7]还对65例全身型MG患者血清进行检测，其中AChR阳性MG17例，MuSK抗体阳性MG24例，血清双阴性MG24例。在这24例血清双阴性MG中簇集性AChR抗体阳性为14例。2015年，Zhao等[16]利用同样的基于细胞学的检测方法(cell-based assay，CBA)，对我国24例SNMG患者血清进行检测，发现其中11例(45.8%)为簇集性AChR抗体阳性MG。并且这些患者的临床表现与AChR抗体阳性MG无显著差异。因此，可以认为簇集性AChR抗体阳性MG与AChR抗体阳性MG是针对同一靶点的一类疾病，只是因为对RIPA 及ELISA 敏感度不如CBA，难以检测到低亲和力的AChR抗体。

4 横纹肌抗体相关的MG

横纹肌抗体，又称为非NJM抗体，是指MG患者血清中针对横纹肌组分的特异性抗体，包括肌动蛋白、肌球蛋白、肌联蛋白(titin)、Kv1.4及兰尼碱(ryanodine receptor，RyR)抗体等。其中，研究较多的是titin、Kv1.4及RyR抗体。

4.1 肌联蛋白(titin) 是一种定位于横纹肌纤维内的大分子蛋白，对于维持细胞的弹性及肌肉的收缩运动起到重要作用。Stergiou等[14]针对titin在MG中表达情况进行了多中心研究，发现titin抗体阳性的MG占AChR抗体阳性MG的40.9%，占MuSK抗体阳性MG的14.6%，占LRP4抗体阳性MG的16.4%，占血清三阴性MG的13.4%。其中titin抗体阳性的血清三阴性MG患者临床症状轻微，90%患者的MGFA分级为Ⅰ级、Ⅱ级， 10%为Ⅲ级。而且这些患者对于临床治疗敏感，胆碱酯酶抑制药及免疫抑制治疗均能起到较好的疗效。但是，在AChR抗体阳性的MG患者中，titin抗体阳性提示较严重的临床表现及较高的胸腺瘤风险。Hong等[17]检测了437例我国MG患者的血清抗体，其中titin抗体阳性且RyR抗体阴性患者占16.5%，RyR抗体阳性且titin抗体阴性患者占11.9%，titin抗体及RyR抗体双阳性患者11.9%，且这部分横纹肌抗体阳性的MG患者血清中AChR抗体阳性率接近100%。

4.2 Kv1.4及RyR 均是在肌肉收缩过程中起到重要作用离子通道蛋白，其中RyR是肌浆网内的Ca2+通道，而Kv1.4是电压门控K+通道的组成部分。Kufukihara等[18]利用基于细胞学的检测方法检测了30例MG合并肌炎及心肌炎患者的血清横纹肌抗体，发现在合并肌炎及心肌炎的MG患者血清中titin抗体阳性比例为93%，RyR抗体阳性比例为73%，Kv1.4抗体阳性比例为50%。提示横纹肌抗体，尤其是titin抗体MG合并肌炎及心肌炎患者的诊断中具有较大价值。

与其他的胞内抗体类似，横纹肌抗体是潜在的肿瘤标志物。尤其是在合并有AChR抗体阳性的晚发型MG中，横纹肌抗体阳性预示着胸腺瘤的高风险。相关临床研究表明，胸腺瘤相关MG的横纹肌抗体阳性率为50%～70%。其中，titin抗体阳性诊断胸腺瘤相关MG的特异度为80.8%，而RyR抗体的特异度为85.7%[19]。

5 其他抗体阳性的MG

除了上述的AChR抗体、MuSK抗体、LRP4及横纹肌抗体外，多种MG的致病抗体已被识别。如ColQ抗体、皮层蛋白(cortactin)抗体、Agrin抗体等。ColQ是乙酰胆碱酯酶复合体的一部分，通过其C末端同MuSK的胞外段结合，从而将乙酰胆碱酯酶锚定于NMJ突触后膜[20]。ColQ抗体一方面影响了NMJ突触后膜乙酰胆碱酯酶的功能，另一方面干扰了LRP4-MuSK信号传导通路及AChR的簇集表达。Zoltowska等[21]检测了415例MG患者的血清中ColQ抗体的表达情况，仅发现12例阳性表达。且这12例中，5例合并AChR抗体阳性，2例合并MuSK抗体阳性。由于ColQ起到锚定乙酰胆碱酯酶的作用，被抗体破坏后将影响乙酰胆碱酯酶的功能，因此这部分ColQ抗体阳性的MG患者很可能对乙酰胆碱酯酶抑制药不敏感。但由于ColQ抗体临床检测尚未普及，因此相关队列较少，ColQ抗体阳性的MG的临床表现及对常规治疗的效果尚需进一步研究。

Cortactin是LRP4-MuSK信号传导通路的下游信号转导蛋白，在AChR 的簇集表达中起到中介作用。DNMG患者血清中Cortactin抗体的阳性率为20%。而在AChR抗体阳性的MG患者血清中Cortactin抗体的阳性率不到10%[22]。因此，目前认为Cortactin是MG致病的重要独立靶点之一。Gallardo等[23]检测了38例DNMG患者的血清，其中9例Cortactin抗体为阳性，且这部分Cortactin抗体阳性的MG患者与AChR抗体阳性的MG患者相比，临床表现更为轻微，多以眼肌型及轻度全身型为主，较少累计咽喉肌和呼吸肌，预后较好。值得注意的是，这9例Cortactin抗体阳性的MG患者均未发现胸腺瘤。但是否Cortactin抗体阳性的MG与胸腺瘤无关尚需进一步的研究与探讨。

Agrin是一种由突触前膜分泌的硫酸类肝素多糖蛋白。其生理作用在于易化LRP4-MuSK信号通路的传导，从而使AChR在NMJ突触后膜簇集表达。MG患者血清中可检测到Agrin抗体的存在，可能通过干扰LRP4-MuSK信号通路而致病。Cordts检测了100例MG患者的血清中抗体的表达情况，在55例AChR抗体阳性及45例AChR抗体阴性的血清中，Agrin阳性率分别为5%和2%。这部分Agrin阳性的MG患者多为早发型MG，临床症状与AChR抗体阳性的MG并无明显差异[24]。

SNMG的概念是伴随着MG相关抗体的发现及检测手段的完善而不断变化的。20世纪70年代，当人们认识到AChR抗体在MG发病过程中的主导地位时，Burges指出SNMG是一类AChR抗体阴性的MG[5]。但随着研究的深入，MuSK及LRP4抗体被逐渐认识并用于临床检测， SNMG的新概念逐步扩展为血清双阴性MG及血清三阴性MG。有学者将MG分为七类，包括AChR抗体阳性的早发型MG、AchR抗体阳性的晚发型MG、眼肌型MG、胸腺瘤相关的MG、MuSK抗体相关的MG，LRP4抗体相关的MG及SNMG[25]。目前，这样的基于临床表现及抗体异质性的分类已得到广泛认同。这样的分类能够帮助临床医师更好地识别病因机制、预测病情发展并选择恰当的治疗手段。

总之，即使多种MG相关抗体被发现，但仍有部分MG患者血清中未检测到已知抗体，这些患者临床症状相对轻，以眼肌型为主，胸腺检查多为正常，治疗效果理想。这类患者抗体靶点可能定位于NMJ突触后膜的非AChR组分，通过影响NMJ突触后膜AChR与乙酰胆碱的结合效率而致病。我们有理由相信随着更多的MG致病抗体被发现，SNMG在MG中的比例将会越来越小。