外泌体microRNAs作为肺部疾病诊断性生物标志物的研究进展

姚培学 郭小旭 贺艳飞 欧阳瑶

遵义医科大学附属医院呼吸与危重症医学科呼吸一病区（贵州遵义563000）

近年来，肺部疾病已严重危害人类的身体健康，尤其是慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）、肺癌、特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）、支气管哮喘、肺结核等慢性肺部疾病，目前已成为全球人类死亡的主要原因之一，给社会和医疗卫生系统带来严重的经济负担［1］。据统计，2017年慢阻肺的死亡人数达320 万，预计2040年每年将达到440 万［2］。研究［3］显示，我国40 岁以上人群慢阻肺的平均患病率为13.6%，女性为8.1%，男性为19.0%。肺部疾病管理和治疗的主要挑战之一是缺乏可靠、精确及有效的诊断方法。临床表现、肺功能检测和影像学检查是诊断和评估肺部疾病严重程度的主要指标，然而，它们并不能诊断亚临床疾病状态。因此，迫切需要分子生物标志物来检测肺部疾病的亚临床和严重程度，有助于呼吸系统疾病患者的个体化治疗。目前临床上用于诊断的实验室指标如C 反应蛋白、降钙素原、可溶性髓系细胞触发受体1 等缺乏特异性，因此不能对肺部疾病进行早期诊断，因而探索新的特异性生物标志物迫在眉睫。外泌体作为细胞外囊泡的主要类型，由于具有完整的双层膜结构，微环境对其干扰小，其内包含大量的遗传物质，介导细胞间的通讯，使其在疾病诊断方面具有独特的优越性［4］。MiRNAs 是外泌体中主要的遗传物质，外泌体miRNAs 广泛参与细胞凋亡增殖、免疫调节和新生血管形成［5-7］。外泌体miRNAs 可作为各系统疾病的诊断性生物标志物，尤其是肺部疾病，但其发病机制尚未明确，进一步探讨其发病机制及靶向治疗药物，在临床应用中具有广阔的前景。

1 外泌体miRNAs

外泌体是纳米级大小的膜性封闭囊泡，可由多种细胞通过胞吐作用释放到细胞外形成［8］。HESSVIK 等［9］首次在成熟的羊网状红细胞中发现了这种囊泡，并将其命名为外泌体。外泌体广泛分布于唾液、血液、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和痰液等各种体液中［10］。通过查阅外泌体数据库（http：//www.exocarta.org），不同物种来源的外泌体包含2 838 种miRNAs、3 408种mRNAs、41 860 种蛋白质等多种生物活性分子。MiRNAs 是一类在真核生物体内发现的短序、内源性非编码RNA，由21 ～25 个核苷酸组成，调节转录后基因表达，广泛参与细胞生长、组织分化、免疫反应的调节、上皮间质转化等生理或病理进程［11］，尤其在肺部疾病，如慢阻肺、支气管哮喘、IPF、肺癌等。MiRNAs 在各种体液中以组织和细胞特异性的方式存在，由于具有特异性表达，与各系统疾病的诊断和预后密切相关［12］。特异性miRNAs 在肺部疾病中释放入各种体液，可用于肺部疾病的监测［7］。随着外泌体研究领域的不断深入，体液中外泌体miRNAs 扩增度的灵敏性增加，同时miRNAs 扩增出现阴性结果的可能性减少。成熟miRNAs 占外泌体总RNAs 的41.72%［13］，因此，外泌体可作为miRNAs 研究的可靠载体。外泌体主要通过旁分泌作用将携带的遗传信息释放到细胞外间隙，从而作用于供体细胞发挥生物学效应。供体细胞有一种特殊的分选机制来引导特定的miRNAs 进入外泌体，并对其中的目标基因进行“重编程”［14］。外泌体miRNAs 作为各种疾病的诊断性生物标志物，其主要的原因包括：（1）与循环中miRNAs 相比，外泌体miRNAs 具有高度稳定性及富集性［15］；（2）外泌体miRNAs 能准确反映起始细胞的生理状态和微环境，且大多数细胞能分泌大量特异性的miRNAs［16］；（3）外泌体可将miRNAs释放到邻近和远端细胞中并发挥生物学效应［12］；（4）外泌体的磷脂双分子层结构保护miRNAs 不被血浆核糖核酸酶的降解，使它们能够在细胞外空间稳定表达，有利于标本的采集和储存［4］。

近年来，研究发现外泌体miRNAs 已成为细胞间通讯的重要参与者，并作为多系统疾病的生物标志物，包括神经系统疾病［17］、心血管系统疾病［18］、泌尿系统疾病［19］，尤其是肺部疾病［7］。根据细胞组织来源不同，外泌体miRNAs 具有不同的生物学特性，因此，不同肺脏细胞源性外泌体miRNAs 表达水平与肺部疾病的发生发展密切相关。

2 外泌体miRNAs 与肺部疾病

外泌体miRNAs 作为肺结核、慢阻肺、IPF、支气管哮喘和腺病毒性肺炎等肺部疾病新的诊断性生物标志物具有潜在的研究前景。近年来，MiRNAs 包裹入外泌体、凋亡体和细胞微泡等细胞外囊泡的研究不断引起研究者的兴趣。研究发现外泌体miRNAs 通过影响受体细胞内的信号通路，从而导致受体细胞功能的改变和病理状态的发展［20］。因此，外泌体miRNAs 可作为肺部疾病潜在的诊断性生物标志物。

2.1 外泌体miRNAs 与慢性阻塞性肺疾病慢阻肺是一种慢性炎症性肺部疾病，研究发现各种体液（包括血清、血浆和BALF）中的外泌体miRNAs可作为慢阻肺早期诊断、判断病情严重程度和预后的特异性生物标志物。SUNDAR 等［21］研究发现吸烟的慢阻肺患者血浆中miR-22-3p、miR-151a-5p、miR-151b、miR-22-3p、miR-320b、miR-99a-5p、miR-320d 表达水平明显升高，进一步研究发现外泌体中的miRNAs 通过调节上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）过程而参与慢阻肺的发生发展过程。XU 等［22］研究发现香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）可以诱导支气管上皮细胞来源的外泌体成分发生改变，支气管上皮细胞来源的外泌体miRNA-21通过靶向肿瘤抑制蛋白/缺氧诱导因子1α信号通路促进肌成纤维细胞的分化，从而导致气道重塑，进一步证实吸烟者和慢阻肺患者血清中miRNA-21 的表达增加，且与第1 秒用力呼气容积比用力肺活量（FEV1/FVC）呈负相关，说明外泌体miRNA-21可作为诊断和评估慢阻肺肺功能严重程度的生物标志物。HE 等［23］研究发现CSE 刺激支气管上皮细胞分泌miRNA-21，可通过抑制M2 巨噬细胞的极化，从而间接调节EMT 过程而参与慢阻肺的发病过程。SERBAN等［24］发现CSE 可导致小鼠血浆和原代肺微血管内皮细胞上清液中外泌体miR-191、miR-126、miR-125a 和let-7d 的表达增加，这些外泌体miRNAs 可通过调控巨噬细胞功能而影响慢阻肺的进展。综上所述，慢阻肺患者及实验动物体液中外泌体miRNAs 的表达水平均有升高，这说明可作为慢阻肺的诊断性生物标志物，但是外泌体miRNAs 参与慢阻肺气道重塑的机制尚未明确，这些研究机制在慢阻肺的靶向治疗中具有深远的研究意义。

2.2 外泌体miRNAs 与支气管哮喘支气管哮喘是一种以慢性气道炎症、气道高反应、可逆性气流受限为特点的异质性疾病。外泌体miRNAs 作为细胞间信息传递的重要中介，在支气管哮喘的发病机制中发挥重要的作用。PUA 等［25］研究发现，支气管哮喘模型BALF 中外泌体miR-223 和miR-142a 表达显著增加，同时证实支气管哮喘小鼠模型BALF 中部分外泌体miRNAs 可能影响肺部炎症而促进支气管哮喘的发生发展，提示这些外泌体miRNAs 可作为支气管哮喘的特异性诊断性生物标志物。另有研究发现，室内尘螨诱导的支气管哮喘小鼠模型BALF 中外泌体miRNAs 的表达量增高8.9 倍，其中54 种外泌体miRNAs 在气道和肺组织中呈负相关，且部分外泌体miRNAs 靶向作用于IL-13 基因，引起表达水平上调，从而促进支气管哮喘的发生发展［26］。外泌体miRNAs 与炎性细胞相关哮喘及过敏原诱发的哮喘有关，主要通过气道上皮细胞和支气管平滑肌细胞的凋亡及增殖导致气道重塑，但能否靶向作用于炎性细胞发挥作用有待进一步研究及探索。

2.3 外泌体miRNAs 与特发性肺纤维化IPF 是一种病因未明的弥漫性肺纤维化疾病，且致残率、病死率高，极具侵袭性。NJOCK 等［10］研究发现IPF 患者痰液中外泌体miR-33a-5p、miR-142-3p、miR-145-5p 和miR-374a-5p 的表达水平显著升高，而miR-92b-3p、miR-24-3p 、miR-26a-5p 和miR-30a-5p 的表达水平显著降低，表明特异性外泌体miRNAs 对IPF 的诊断具有重要参考价值。进一步研究发现，miR-142-3p 与一氧化碳弥散量与肺泡通气量之比呈负相关，而let-7d-5p 水平呈正相关。MAKIGUCHI 等［27］研究发现，IPF 患者血清中的外泌体miR-21-5p 显著上调。这使得外泌体miRNAs可作为IPF 非侵入性的诊断性生物标志物，间接说明外泌体miRNA 具体促进纤维化的作用，但其具体机制不明，有待进一步研究，以指导相关靶向抗纤维化药物应用于临床。

2.4 外泌体miRNAs 与肺结核肺结核是由结核分枝杆菌感染引起的慢性消耗性疾病，由于漏诊及误诊率较高，不能早期有效规律的抗结核治疗，从而严重的危害人类的身体健康。然而，目前诊断肺结核的方法由于缺乏其敏感性和特异性。因此，迫切需要新的生物标志物来帮助肺结核的早期诊断和治疗。研究已证实外泌体miRNAs 可作为肺结核的诊断性生物标志物。ALIPOOR 等［28］研究发现，肺结核患者血清外泌体miR-484、miR-425和miR-96 表达水平显著升高，然而根据痰涂片阳性程度分析发现，随着痰菌量增多，这3 种血清外泌体miRNAs 表达水平均有差异性，证实这3 种血清外泌体miRNAs 与结核分枝杆菌感染的严重程度密切相关。LYU 等［29］通过对60 例健康对照组、60 例潜伏期结核分枝杆菌感染患者（LTBI）和60 例活动性肺结核患者（ATB）血清外泌体miRNAs 的表达谱分析发现，LTBI 血清外泌体miR-let-7e-5p、miR-let-7d-5p、miR-450a-5p 和miR-140-5p 表达水平明显升高，而ATB 血清外泌体miR-1246、miR-2110、miR-370-3P 和miR-28-3p、miR-193b-5p 表达水平显著升高。另有研究发现，血浆外泌体miRNAs 与电子健康记录（EHR）相结合对结核病的诊断具有显著的临床意义，与对照组相比，结核病患者血浆中外泌体miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-106a、miR-191 和miR-486 具有差异性表达，血浆外泌体miRNAs 的表达水平和HER 结合具有潜在的临床诊断价值，且对肺结核诊断的灵敏度、特异度分别为100%、84%［30］。综上所述，外泌体miRNAs可作为肺结核的早期诊断性生物标志物及评估病情的严重程度，便于指导临床早期治疗，减少复发，改善患者的远期预后及提高生存质量。

2.5 外泌体miRNAs 与肺癌肺癌是呼吸系统的恶性肿瘤之一，其发病率及病死率均居高不下，且年发病率明显升高。外泌体miRNAs 可作为肺癌细胞与其他细胞之间信息交换的重要媒介，在肿瘤的病理过程中发挥着重要作用。LIU 等［31］通过10 例非小细胞肺癌（NSCLC）患者和10 例健康对照组研究发现，两组之间存在30 个差异性表达的miRNAs，随着研究的深入，发现血浆外泌体miR-23b-3p、miR-10b-5p 和miR-21-5p 与NSCLC 患者的总体生存率相关，可作为评估NSCLC 患者预后的生物标志物。ZHANG 等［32］发现，NSCLC 患者血清外泌体miR-17-5P 表达水平明显高于健康对照组；同时，外泌体miRNAs 也可作为鉴别不同类型NSCLC 的生物标志物。进一步研究证实血浆中外泌体miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p 和miR-361-5p 是腺癌的特异性诊断性生物标志物，而血浆中外泌体miR-10b-5p、miR-15b-5p 和miR-320b可作为鳞癌的特异性诊断性生物标志物［33］。XUE等［34］研究发现，与对照组相比，肺腺癌患者血浆外泌体miR-484 表达水平明显升高；与肺腺癌患者术前相比，肺腺癌患者术后血浆外泌体miR-484 表达水平显著降低，提示血浆外泌体miR-484 有望成为肺腺癌诊断和预后的生物标志物。外泌体miRNAs 可作为肺癌的生物标志物，可应用于肺癌的诊断和分型，但介导肺癌发病的机制尚未明确，若能探索清楚肺癌的发病机制，可进一步开发阻断这些机制的药物，从而降低肺癌的发病率。

2.6 外泌体miRNAs 与腺病毒性肺炎腺病毒性肺炎是由人腺病毒感染引起的间质性肺炎，其发病率及病死率较高，然而腺病毒性肺炎在临床的诊疗工作仍面临着巨大的挑战。因此早期诊断及早期治疗能改善其预后，故探索其早期诊断的生物标志物具有深远的研究意义。HUANG 等［35］研究发现，腺病毒性肺炎患者全血中miR-629-3p、miR-223-3p 和miR-142-3p 表达水平明显升高，这说明血源性miRNAs在腺病毒性肺炎中具有潜在的研究背景。HUANG等［36］通过实时荧光定量PCR 分析5 例腺病毒性肺炎患者和4 例健康对照组血清外泌体miRNAs 表达情况发现，腺病毒性肺炎患者血清中外泌体miR-450a-5p、miR-103a-3p、miR-103b-5p 和miR-98-5p 具有差异性表达，这说明外泌体miRNAs 可作为诊断腺病毒性肺炎的候选生物标志物。

3 总结与展望

随着各种体液（血液、痰液、BALF 等）中外泌体miRNAs 的发现，外泌体miRNAs 也成为慢阻肺、支气管哮喘、IPF、肺结核、肺癌和腺病毒性肺炎等慢性肺部疾病早期诊断的研究热点。经过不懈的努力，目前国内外对外泌体miRNAs 作为慢性肺部疾病的诊断性生物标志物取得新的进展，但仍处于初级阶段，仍有问题急需解决：（1）外泌体miRNAs 与肺部疾病的发病机制研究尚浅，尚未系统、深入阐述。（2）缺乏简单、有效的早期诊断手段和靶向治疗药物。（3）肺部疾病存在病因多样、发病机制复杂等特点，目前尚未发现特异的外泌体miRNAs 作用靶点。（4）尽管体液中的外泌体miRNAs 可作为疾病早期诊断的潜在标志物，但大多处于基础研究阶段，且规模较小，缺乏大样本和多中心的验证。（5）现今分离和富集体液外泌体的技术和方法较多，但存在程序复杂、设备昂贵等问题，难以在临床推广应用，使得外泌体miRNAs 的应用也受到限制。为此，需要进一步系统研究各种体液中外泌体miRNAs 与肺部疾病的发病机制，为将来研究出带有保护性物质（抗炎/抗纤维化miRNAs）的外泌体用于治疗肺部疾病。