气溶胶和飞沫将是肺部感染诊断的新标本

蒲荣 周小棉

1东莞市松山湖中心医院检验科（广东东莞523326）；2广东省广州市宝创生物技术有限公司（广州510663）

由于缺乏安全和低成本的方式获得足够病毒或细菌含量标本，目前肺部感染的诊断受到限制。冠状病毒的一个重要的特点是通过痰和飞沫或气溶胶传播，现有的诊断方法，由于病程中排病毒时机未知，造成口腔、鼻咽部取样所致的分子诊断样本阳性率低（30% ～50%）；同时，因咽拭子样本取样困难，不仅会消耗大量的医疗资源，甚至会引起医务人员感染［1］。通过气溶胶和飞沫进行诊断肺部感染可能是未来新的发展方向。

1 肺部标本与局限性

目前诊断肺部感染最常用的标本是咳痰和咽拭子样本。然而，各种疾病导致的痰液分泌差异很大。通常可自发或通过吸入生理盐水诱导获得，但对肺结核患者或囊性纤维化导致的支气管扩张患者会使其支气管扩张加重。与此相反，约50%结节性支气管扩张（非结核分枝杆菌）感染患者无痰，约1/3 的细菌性肺炎患者可能无痰。一个关键的问题是痰标本的质量，因为许多采集的痰来自上呼吸道，不能代表下呼吸道。儿童通常不能提供高质量的痰标本，因此病原体通常通过临床表现、流行病学、实验室或放射学模式来推断。如果无法获得高质量的痰标本，特别是如果患者病情严重，通常需要通过支气管镜获得肺泡灌洗液检查。而咽拭子取样虽然简单快速，但也存在如下不足：（1）疾病指征及留取时间把握不够，造成结果的参考价值较低。（2）标本采集部位不正确，没有采集到病灶所在部位分泌物，尤其是鼻拭子，采集部位往往较浅，没有达到鼻前庭。（3）操作者业务知识欠缺，对操作标准及流程掌握不够。因此，造成阳性率低，假阴性率高的现象。然而，肺部病毒感染或少数细菌感染一个重要的特点是通过患者或带菌者的飞沫和呼吸气溶胶传播。气溶胶是导致这些疾病防控难度增加的重要原因。流感和SARS 传播尤其明显，种种迹象表明新型冠状病毒肺炎（COVID-19）也可能存在气溶胶传播［2］。因此，飞沫和气溶胶有潜力成为临床上有用的标本。

2 气溶胶和飞沫作为肺部感染诊断的研究进展

在过去的二十年里，在收集传染性气溶胶方面有了很大的进展，尤其是在结核病和流感的研究方面。

2.1 结核杆菌可通过气溶胶传播结核杆菌病莱利等［3］进行了一项精妙的研究，证明了通过空气传播结核病的可能性。他们证明，豚鼠在呼吸了一个偏远的实验病房里住有结核病患者的空气后，就患上了结核杆菌病。在一项新型咳嗽气溶胶采样系统（CASS）的初步概念验证研究［4］中，12 例住院肺结核患者中只有4 例患者（25%）因自愿咳嗽产生的气溶胶可培养结核菌。随后的6 组来自乌干达和巴西的涂片阳性培养证明结核病患者发现，43%（100/233）的患者产生了可培养的气溶胶，其中24%（57/233）是高气溶胶生产者（气溶胶采样产生≥10 菌落形成单位（cfu）的结核分枝杆菌）［5-7］。另外两项来自南非的研究，一项是对CASS 方法稍作修改，另一项是让患者坐在取样室内固定式呼吸气溶胶取样［8-9］。研究［9］结果表明，传染性气溶胶的产生仅与痰涂片等级或液体培养基中的阳性时间测量的细菌负荷有部分关系，并且在开始结核病治疗后迅速减少。在巴西和乌干达的研究中，气溶胶检测方法比痰菌涂片更能预测家庭接触者的结核病感染风险。此外，微生物学实验进一步证实，继发结核病患者主要发生在气溶胶阳性结核病例的居家密切接触者中［3］。南非两个不同研究小组的咳嗽气溶胶培养结果与另一个研究小组在乌干达和巴西发现的结果相似，使用聚合酶链式反应聚合酶链反应（PCR）分析可以在呼气中发现比固体培养中的菌落形成单位更高浓度的分子信号［9］。另外，英国的一个研究小组利用分子检测方法在用改良的口罩收集肺结核患者呼出的气休中发现了高浓度的结核分枝杆菌DNA［10］。虽然分子检测与培养方法的结果不一致，但收集的气溶胶不失为一种很有前途的样本。两者不同的原因可能是由于气溶胶中细菌的生存能力不同，但这需要进一步的研究。

2.2 流感病毒可通过气溶胶和飞沫传播目前研究认为流感至少一部分是通过接触和飞沫传播的。然而，越来越多的证据表明，空中传播的雾滴核也发挥了重要作用，特别是在短期范围。病毒性呼吸道感染现在通常通过收集呼吸道黏液样本并用抗原或基于聚合酶链反应的系统进行分析来诊断。目前，从呼吸道取得临床样本的常用方法有鼻咽拭子、鼻咽分泌物和鼻腔清洗液、气管分泌物、支气管肺泡灌洗或痰液收集。这些技术都有缺点：鼻咽拭子、口咽拭子、吸出物和洗涤物从上呼吸道提供黏液，而上呼吸道并不总是包含相同的病毒载量或者相同种类的病毒［11］。鼻咽拭子的采集对患者，尤其是儿科患者来说是不舒服的，儿科常常首选鼻腔清洗液和鼻咽分泌物。支气管肺泡灌洗提供了一个更加确定的下呼吸道感染样本，但是这个过程相当具有侵入性，因此很少使用。痰液通常含有上呼吸道黏液，人为产生痰液对患者来说是困难和难以忍受的，可能需要雾化吸入，这可能导致支气管痉挛。

患者在咳嗽和潮汐呼吸过程中产生的气溶胶粒子的收集可能为收集呼吸道病毒的诊断标本提供一种非侵入性的方法。在受感染患者呼出的气和咳嗽气雾剂中检测到呼吸道病毒，特别是流感病毒［11］。MILTON等［12］收集了37例受试者在30 min内呼气和咳嗽中的气溶胶粒子，并在35个样本（95%）中发现了流感病毒DNA。LINDSLEY等［15］从47例流感阳性受试者咳嗽中收集了这些粒子，在38个样本中检测到了流感DNA。MILTON 等［12］及YAN 等［13］还发现，鼻咽拭子中的流感病毒拷贝数量远低于气溶胶粒子的拷贝数量，两者只有微弱的相关性，这表明气溶胶粒子感染源于肺部感染，而不是源于呼吸道头部。同时也发现，对于流感患者，有时观察到鼻咽拭子阴性的患者咳嗽气溶胶和飞沫呈阳性［14］。这些观察和越来越敏感的分子标记物的发展表明，咳嗽或呼吸气溶胶有可能被用作诊断疾病的标本。因此，与鼻咽拭子相比，呼吸道气溶胶可能为下呼吸道感染提供更具代表性的诊断标本来源。

2.3 SARS 和禽流感病毒可通过气溶胶传播2004年中国香港学者在《新英格兰医学杂志》发表论文，分析香港淘大花园多人集中感染严重急性呼吸综合征（SARS）病毒的案例，推断病毒通过楼宇间的气溶胶传播［14］。此外，还有学者利用雪貂研究了禽流感病毒通过气溶胶传播的能力［15］。BERTRAN等［16］在实验室模拟处理感染了人源H5N1病毒的无症状鸡（族群1 和2.2.1）和禽源H5N1 病毒的鸡（族群1.1、2.2 和2.1）时，检测到了传染性飞沫和气溶胶，证明在家庭或活禽市场屠宰受感染的家禽时，禽类和家禽之间可以通过空气传播禽流感病毒。在COVID-19 感染方面，不仅存在飞沫和痰等直接接触传播，也可能存在通过气溶胶间接传播的高风险。国家《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第六版）》已经将气溶胶传播列入其中。因此，疑似患者和患者的呼出的气溶胶和飞沫中病毒或细菌的安全、有效收集是面临的关键问题。

3 取样方法的研究进展

近十多年以来，全球的科研工作者对气溶胶和飞沫的收集也做了一些有益的探索。各种取样装置可用于回收空气中的病毒。最常见的是液体和固体冲击器（如安德森采样器、狭缝采样器和旋风采样器，通常能更有效地捕获大颗粒），以及过滤器和静电除尘器［17］。但其中绝大多数是利用自建的大型气溶胶收集器进行流感或结核传染力的研究。研究人员从13 例患有慢性阻塞性肺病（COPD）的患者（其中5 例患者与同期痰液样本配对）和10名健康人对照中，抽取了15 min口罩样本，从患者样本中提取了DNA［20］。英国的一个研究小组利用外科口罩和改良的口罩（含有明胶过滤膜）收集患者呼吸气体和飞沫，结果发现使用外科口罩的提取物对PCR 反应有强烈的抑制作用，而明胶过滤膜提取物的抑制作用很小或没有抑制作用。他们还利用PCR分子方法在6个肺结核患者的3 个口罩中发现了高浓度的结核分枝杆菌DNA［10］。这就提出了一种可能性，即在某些情况下，口罩式取样可能会避免或降低那种昂贵的、侵入性的取样方法。从方便、安全、经济和普适性等方面考虑，口罩取样可能为涂片阴性或失能的患者提供一种更好的替代取样工具。有研究［19］表明，为了提高诊断用口罩取样的灵敏度，可以增加取样次数和时间以及采用更灵敏的分子分析法。

4 展望

综上所述，微生物气溶胶可能更能代表病毒性疾病中的下呼吸道疾病，在这种疾病中痰液的产生并不常见。微生物气溶胶作为疾病的诊断性测试，对于收集痰液特别具有挑战性的人群可能特别有用，例如儿童、感染人类免疫缺陷病毒的患者、其他免疫抑制患者和老年人。由于呼出气溶胶和飞沫采集是非侵入性的，所以重复采集比传统方法更易被患者接受。如果提高检测方法的灵敏度，呼出的气溶胶和飞沫分析可以成为诊断呼吸道感染和监测病程和治疗反应的有用工具，而气溶胶和飞沫将是肺部感染诊断的新标本。