miRNA调控成骨分化及矿化的研究进展

袁嘉尧 林燕平 黄佳纯 黄宏兴

1广州中医药大学（广州510000）；2广州中医药大学第三附属医院骨科（广州510000）

骨质疏松症（osteoporosis）是以骨量减少、骨质量受损及骨强度降低，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病，临床表现主要有周身疼痛、身高降低、驼背、脆性骨折及呼吸系统受影响等［1］。流行病学调查［2］发现，骨质疏松症已经成为我国50 岁以上人群的重要健康问题：50 岁和65 岁以上人群骨质疏松症患病率分别为19.2%和32%；其中，中老年女性骨质疏松问题尤为严重。由于骨质疏松症的患病人数较多，其临床症状及并发症严重影响老年人的生存质量，危害他们的生命安全；而对骨质疏松症的诊断多依靠疾病发生后的表现，如骨密度下降、出现全身骨痛症状或者发生脆性骨折等。因此，探讨骨质疏松症防治和预测方法具有重要的临床意义。

miRNA 是近年来发现的具有重要细胞调节作用的微小RNA 家族，参与了一系列细胞活动的调节，包括细胞分化、增殖和凋亡；加强对miRNA调控成骨分化及矿化功能的调节机制的研究，有助于发现防治骨质疏松症的新位点和研制新药物，创新防治及预测骨质疏松症的方法。

1 miRNA 概述

miRNA 是一类非编码、单链RNA 分子，大约由21 ～25 个核苷酸组成，负责调控基因的表达。由于编码miRNA 内5 ～7 个核苷酸核心的种子序列的碱基配对不完美，因此可以潜在地识别许多用于结合的mRNA 序列；这些miRNA 已经成为多细胞动物和植物基因表达的关键转录后调节因子，通过与mRNA 的3′非翻译区（UTR）中的互补序列结合，发挥其阻断蛋白质翻译和调节mRNA稳定性的作用［3］。研究人员预测在哺乳动物中大约有30%的蛋白质编码基因的活性是由miRNA 控制的；功能研究［4］表明，miRNA 参与几乎每一个已被研究的细胞过程的调节，它们表达的变化与许多人类病理具有相关性。据估计，miRNA 调控约60%的人类基因组，但在通过骨骼细胞体外表达谱鉴定的许多miRNA 中，仅有一小部分miRNA 的功能活性和已知靶点已经被证实［3］，但仍有许多miRNA 的作用靶点和功能活性未被阐明。miRNA可以调节生物的生命活动，但对其的研究还不够深入和广泛，未能最大发挥miRNA 对骨质疏松症的防治潜能；研究miRNA 对成骨分化及矿化的影响机制，挖掘其对骨质疏松症的防治作用，对防治骨质疏松症具有重大意义。下文将对miRNA 对成骨分化及矿化的正向调节和负向调节作用两个方面以及涉及的相关通路进行综述。

2 miRNA对成骨分化及矿化的正向调节作用

研究人员发现部分miRNA 通过靶向作用，刺激相关mRNA 和蛋白质的表达，促进成骨分化及矿化。如ARUMUGAM 等［5］用紫丁香酸处理小鼠间充质干细胞后，miR-21 的表达增加，抑制Smad7的表达使Runx2 的表达增加，导致成骨细胞分化增加；TU 等［6］发现MC3T3-E1 成骨细胞中miR-142-5p 表达的激活可以靶向抑制含WW 结构域的E3泛素蛋白连接酶1（WWP1）表达，增加Runx2、JunB和骨钙素（OCN）的mRNA 水平，在骨愈合过程中增强了成骨细胞的活性和骨基质矿化。YANG等［7］发现SP7 转录因子可促进miR-98 的表达，而miR-98 会抑制Fiat 蛋白的表达，促进小鼠原代成骨细胞的矿化。YIN 等［8］发现miR-135-5p 通过阻碍缺氧诱导因子1α 抑制剂（HIF1AN）的翻译，促进MC3T3-E1 细胞的成骨分化和矿化；表现为ALP 活性、钙化和Runx2、成骨相关转录因子抗体（OSX）、骨桥蛋白（OPN）和OCN 水平的增加。KARVANDE等［9］发现甲状旁腺激素通过增加葡萄糖摄取，促进miR-451a 的表达，而miR-451a 则可抑制Osr1（odd-skipped related 1）表达，增加Runx2 、重组人骨形态发生蛋白4（BMP-4）水平，增强BMP-4 诱导的成骨细胞分化，促进成骨细胞的生成、矿化。HE 等［10］发现miR-877-3p 表达的增加可以抑制MC3T3-E1 细胞中Smad7 mRNA 和蛋白的表达，促进TGF-β1 所诱导的MC3T3-E1 细胞向成骨细胞分化的过程。还有研究［11］发现在小鼠颅骨原代成骨细胞中，增加miR-219a-5p 水平会降低维甲酸相关孤核受体β（Rorb）的表达并增加成骨活性，促进成骨细胞分化。LIN 等［12］发现，miR-874 通过靶向抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂（SUFU），激活Hedgehog 信号通路，促进成骨细胞增殖，增加ALP活性和钙结节数量，阻滞成骨细胞于G0/G1 期并抑制细胞凋亡。

以上研究表明，miRNA 通过调控靶基因表达，促进成骨分化和矿化，证实了miRNA 在促进骨形成方面具有巨大潜力；但由于miRNA 对成骨分化及矿化的研究尚处于体外细胞层次，其在体内的作用机制尚未阐明，还需要大量临床样本和动物实验数据支持；同时，大部分研究仍停留在miRNA 对靶基因的影响机制上，尚未结合到通路机制上进行研究，研究者可根据已有的靶点研究，继续挖掘miRNA 影响相关通路促进成骨分化和矿化的影响机制。针对目前已发现的miRNA作用靶点，研制靶向投递人工合成miRNA 或者其模拟物达到精准治疗的效果，并安全有效地将这些人工合成miRNA 或其模拟物转入细胞发挥作用，应该是研究人员的最终努力方向；而目前将miRNA 直接应用于临床防治骨质疏松症尚存在很大的难度。

3 miRNA对成骨分化及矿化的负向调节作用

miRNA 对成骨分化也具有负向调节作用，其中涉及了BMP-Smad 通路和Wnt/β-catenin 等信号通路；也有相关研究表明miRNA 通过调控特定基因的表达负向调节细胞的成骨分化和矿化。

3.1 miRNA 通过靶向BMP-Smad 通路负调控成骨分化及矿化BMP-Smad 通路是参与调节成骨分化重要的信号通路，BMPs 可以激活一系列信号转导分子促进成骨分化。ARFAT 等［13］发现miR-208a-3p 表达的增加可下调MC3T3-E1 细胞中激活素A I 型受体（ACVR1）蛋白的表达，抑制BMP2、Smad1/5 和Smad4 的表达、成骨特异性基因的转录和骨形成。GU 等［14］发现miR-155 通过与小鼠前成骨细胞中Smad5 mRNA 的3′UTR 位点结合，阻碍Smad5 的翻译，抑制成骨细胞的分化，降低ALP表达、活性以及钙化，抑制骨形成。LU 等［15］发现，miR-451a 可以负调控Bmp6 的表达，在成骨细胞发生过程中调节Smad1/5/8 信号通路的激活，抑制骨形成。也有研究［16］发现，miR-224 通过靶向Smad4的3′端非编码区，抑制Smad4 的表达，降低了ALP活性和OCN、OPN、BSP 和Runx2 的表达水平，抑制成骨细胞分化。

3.2 miRNA 通过靶向Wnt/β-catenin 信号通路负调控成骨分化及矿化Wnt/β-catenin 信号通路也是调节成骨分化的重要通路，它能够激发前成骨细胞的增殖能力，诱导成骨细胞的增殖及分化，增加骨量。LIN 等［17］发现miR-26b-3p 通过抑制ER-α和Wnt/β-catenin 的相关RNA 和蛋白的表达，抑制ME3T3-E1 的成骨细胞分化。LI 等［18］发现转染miR-503 后Wnt3a、β-catenin、Runx2 和Bcl-2 的表达受到明显抑制，而caspase-3 的表达则明显上调，表明miR-503 部分通过Wnt 途径，降低MC3T3-E1 细胞中Wnt3a 的mRNA 和蛋白水平，抑制MC3T3-E1 细胞的增殖，促进MC3T3-E1 细胞的凋亡。

3.3 miRNA 通过抑制靶基因表达负调控成骨分化及矿化miRNA 还能通过抑制靶基因表达负调控成骨分化及矿化，但相关基因所涉及的信号通路，仍需进一步研究。ZHANG 等［19］发现miR-133a-5p 可以识别和靶向Runx2 的3′UTR，抑制Runx2 的表达水平，下调成骨分化标志物I 型胶原、OCN 和OPN 的表达，负调控成骨细胞分化和骨形成过程。YI 等［20］发现在人脂肪源性干细胞（ADSCs）向成骨细胞分化过程中，miR-30 的过表达可以抑制OCN、OPN 和OSX 的表达，抑制Runx2 介导的成骨细胞分化。ARUMUGAM 等［21］发现甲状旁腺激素使miR-6797-5p 表达增加，而miR-6797-5p 模拟物的过度表达则显著下调Runx2 蛋白的表达，抑制成骨细胞分化。QIN 等［22］发现miR-494 通过抑制BMP2 和Runx2 的表达，抑制C2C12 细胞成骨分化。FENG 等［23］发现抑制miR-152 可以上调RICTOR 基因的水平，促进ALP、Runx2、OCN 和OSX 的表达，促进成骨细胞分化。有研究［24］发现，miR-193a 通过下调高迁移率族蛋白B1（HMGB1）表达，部分抑制成骨培养基诱导的hBMSC 成骨细胞分化。此外，MENG 等［25］发现miR-590-3p 抑制靶基因人隔蛋白7（SEPT7）的表达，促进人胎儿成骨细胞系hFOB 1.19 细胞凋亡。YUAN 等［26］发现miR-148A-3p 通过靶向和负调节组蛋白去甲基化酶（KDM6B）表达，发挥抗成骨作用。WANG 等［27］发现miR-193a-3p负调控富含亮氨酸重复序列的G 蛋白偶联受体4（LGR4）和激活转录因子4（ATF4）的表达，抑制LGR4/ATF4 信号转导，抑制BMSCs 的成骨分化，并提示miR-193a-3p/LGR4/ATF4调节轴可能在调节骨重塑中发挥重要作用。CHAO等［28］发现miR-195 通过直接靶向RAF-1 蛋白激酶mRNA 的3′-UTR，降低RAF-1 的mRNA 和蛋白表达，抑制RAF-1 诱导的MC3T3-E1 细胞的过度成骨分化。HOU 等［29］发现miR-351 可以通过靶向抑制维生素D 受体VDR 的表达，抑制（+）-胆甾-3-酮诱导的MSCs 成骨分化。GAO 等［30］发现miR-143 可以抑制OSX 的表达，导致骨量下降和骨缺损的发生，最终抑制hBMSCs 的成骨分化。

3.4 miRNAs 通过其他方式负调控成骨分化及矿化除了通过影响通路和抑制靶基因表达，miRNA 还可以通过其他方式负调控成骨分化及矿化，其背后涉及的通路和靶基因仍需进一步研究。有研究［31］发现miR-320a 的过度表达导致人类原代成骨细胞中应力氧化水平增加和矿化能力降低，而这种对成骨细胞的抑制可能与活性氧水平增加有关。SUN 等［32］发现miR-181c-5p 通过抑制细胞周期蛋白B1（cyclin B1）的翻译，降低cyclin B1 表达，使模拟微重力条件下小鼠原代成骨细胞的细胞周期停滞；证明了在模拟微重力下miRNA可部分通过miR-181c-5p/cyclin B1 途径抑制小鼠原代成骨细胞的增殖并诱导细胞周期阻滞在G2 期。LIN 等［33］从采集自女性骨质疏松症患者的血清中，发现miR-338-3p 和miR-3065-5p 显著富集，而进一步的研究发现miR-338 簇的两个成员在体外则可以下调成骨细胞的分化，并且抑制miR-338 簇水平可以延缓OVX 小鼠骨质疏松的进展。ZENG 等［34］发现机械应变上调了骨细胞的miR-29b-3p 水平，从而减少了MLO-Y4 骨细胞的IGF-1 分泌，降低成骨细胞条件培养液中IGF-1 的水平而抑制成骨细胞的分化。

以上研究表明，miRNA 通过与靶基因结合，负调控成骨细胞的功能和活性。后续应在此类研究基础上，研究出针对该种效应的miRNA 抑制剂，抑制其对成骨细胞活性和功能的负向调节作用。如在癌症领域，几种miRNA 靶向疗法已经进入临床开发，包括一种肿瘤抑制因子miR-34 的模拟物，其研究已经到达了治疗癌症的第一阶段临床试验；而针对miR-122 的抗miRs，已经进行到了治疗肝炎的第二阶段试验［35］。还有部分miRNA 被证实可以通过下调Runx2 表达或者其他方式达到负调控成骨分化及矿化的效果，可对其背后所涉及的靶基因和通路进行关注。上述研究结果提示，除了研究对应的miRNA 抑制剂拮抗其抑制成骨分化的作用外，这些负向调控miRNA 也具有对骨质疏松症发生的预测作用。现有的对于骨质疏松症的常用诊断方法如双能X 线测定法不能作为疾病发生的预测手段；而且由于骨密度测定费用较高、技术及仪器要求较高等原因难以在基层医院普及。若能在骨量减少或者骨质疏松症发生之前找到预测指标，并且该类指标具有检验方法简单、快捷、成本低、准确等特点，将会极大提升骨质疏松症的防治水平。已经有许多研究［36-38］发现miRNA 可以作为预测癌症发生的指标，如大肠癌、前列腺癌和甲状腺癌等，因此可以预见miRNA也具有预测骨质疏松症的潜能。由于在各种体液、血清中检测miRNA十分便利，可以快速地非侵入性地检测疾病；在现有的miRNA 调节机制的研究基础上，开发骨质疏松症的miRNA 早期诊断试剂盒，将会更好地造福患者。

4 结语

综上，研究miRNA防治骨质疏松症的下一步工作应该集中于寻找更多与成骨分化相关的miRNA，并且探寻其作用通路，根据研究结果研发相应的促进剂和抑制剂，促进成骨细胞活性和功能，抑制其凋亡。当前对骨代谢的研究仍多数集中在促进成骨细胞活性和增强其功能上，对抑制破骨细胞活性、抑制骨凋亡的研究还不多，因此miRNA 对破骨细胞增殖、分化和功能的研究尚少，今后研究也应该关注miRNA 对破骨细胞的作用机制，研制出相关抑制破骨的药物，创新骨质疏松症的治疗。同时还应该关注miRNA 应用的副作用，miRNA 及其模拟物的生物制备，以及确定miRNA 的作用浓度，如何在体内传递miRNA 使其发挥作用。已有肿瘤方面的研究证明了miRNA 作为肿瘤早期诊断、预后和支持临床决策的理想生物标志物的潜力，而miRNA 在骨质疏松症领域是否也具有如此大的应用潜力，也应该深入研究。