长链非编码RNA在原发性骨肉瘤中的研究进展

任志鹏 康宇翔 胡永成

1天津市天津医院骨科（天津300211）；2天津医科大学研究生院（天津300070）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）好发于儿童及年轻患者，约占儿童肿瘤的5%，据美国国家癌症研究所统计，24 岁以下人群每年骨肉瘤发病率为4.4 例/100 万人，这可能与青春期股骨远端和胫骨近端的骨骺生长板生长迅速有关［1］。尽管通过规范多药方案的新辅助化疗和手术使患者预后得到了改善，但由于早期临床症状不明显，转移发生早及恶性程度高等原因，治疗效果仍不理想；最近几十年来，骨肉瘤的治疗进展甚微，5年生存率也仅为55%～65%，而并发肺转移者2年生存率不到25%，治疗后生存期进入平台期，传统治疗方案难以获得突破性的疗效［2-3］。因此，进一步了解骨肉瘤的发生发展及复发转移的确切机制，探寻早期诊断骨肉瘤的分子标志物以及新的治疗靶点成为该领域的热点。随着基因组学研究的深入，曾经被误认为是“噪音”的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）日益受到重视，目前的研究显示lncRNA 在基因的表达调控、胚胎发育、物种进化、物质代谢以及肿瘤发生及转移等过程均具有重要作用［4-9］。本文将对与骨肉瘤相关的lncRNA 研究进展做一阐述，旨在为骨肉瘤诊治提供新的思路。

1 骨肉瘤与lncRNA 简述

骨肉瘤发病年龄通常呈双峰分布，青少年和老年人发病率最高，青少年患者峰值集中在15 岁，主要为原发性骨肉瘤；老年患者峰值位于75 岁，主要为继发性骨肉瘤，多继发于Paget 病或其他骨损伤。骨肉瘤主要有髓内、表面、骨外3 种亚型，髓内高级别骨肉瘤是经典的病理类型，好发于青少年患者长骨干骺端，占全部骨肉瘤的80%，大多数的文献和研究数据都是基于该类型的原发性骨肉瘤［1］。疼痛是骨肉瘤早期最常见的症状，但由于早期疼痛症状多为间断性，容易与青少年生长痛混淆，而导致确诊较晚，当确诊骨肉瘤时，约80%患者已发生肿瘤转移，最常见于肺部转移［2］。骨肉瘤的病因机制、转移以及耐药性等方面仍然存在较大的模糊区域，生存率并未获得明显地改善［3］。

LncRNA 是一类转录本长度超过200 核苷酸的功能性RNA 分子，早期研究发现其缺乏保守的开放式阅读框（ORFs），因而被认为是“噪音”，没有生物学特性［6］。但随着研究的深入，学者发现lncRNA 在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控、核内运输中起关键作用，参与细胞的组蛋白修饰、染色质重塑、DNA 甲基化、介导基因激活或沉默等作用［5］。大多数lncRNA 由RNA聚合酶Ⅱ转录生成，经转录后加工和修饰成为成熟的lncRNA，大量存在于细胞核，少量位于细胞质中。lncRNA 的主要生物学功能包括了以下几点：（1）作为信号分子，经激活后产生组织或细胞特异性；（2）参与X 染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要调控过程；（3）以多种模式保护蛋白编码基因；（4）含有高效的关键序列，类似于启动子等调控因素，具有比蛋白质更敏感的结构功能限制；（5）既有顺式调控作用，又有反式调控作用，实现靶基因的双向调控［4-9］。

2 骨肉瘤相关lncRNA 的筛选

基因芯片技术被广泛应用于肿瘤相关lncRNA表达谱的筛选。常用方法是将肿瘤组织与正常组织中差异表达的lncRNA 进行高通量测序筛选，然后通过生物信息学比对差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），进行基因本体论（gene ontology）及KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库通路注释及富集分析，最后通过建立lncRNA 基因与靶基因的基因网络图来探索差异表达的lncRNA 与肿瘤的关系。通过上述方法，包括骨肉瘤在内的多种肿瘤相关lncRNA 已被筛选识别。LI 等［10］通过对9 例骨肉瘤及癌旁组织进行检测，发现25 733 个骨肉瘤相关lncRNA 表达，其中403 个表达上调，798 个表达下调；KEGG分析显示，34 条相关信号通道表达上调，32 条相关信号通路表达下调。基因芯片实验有助于骨肉瘤相关lncRNA 的初步筛选，为探寻应用于早期诊断和治疗的新型分子靶标提供了线索，为后续研究提供了方向。

3 lncRNA 辅助骨肉瘤的早期诊断

疼痛是骨肉瘤早期最常见的症状，最初多为间断性疼痛，常与青少年生长痛相混淆，并且影像学表现往往滞后于临床症状，导致确诊较晚［2］。虽然早期检测到血液中碱性磷酸酶增高可以辅助成骨型骨肉瘤的诊断，但由于碱性磷酸酶缺乏特异性，临床诊断价值有限［11］。WANG 等［12］分别对骨肉瘤患者术前术后及健康对照志愿者血清中lncRNA FAL1 的表达情况进行分析，发现术前血清中FAL1 表达量高于术后患者及健康志愿者，并且骨肉瘤术后复发的患者血清FAL1 表达量高于未复发患者及化疗敏感者。HUO 等［13］发现骨肉瘤患者血清中lncRNA MALAT1 的表达水平在较健康个体显著升高，并且与肿瘤大小及远处转移等存在相关关系。联合血清lncRNA MALAT1、ALP的AUC检查可将诊断敏感度及特异度分别由80.8%和72.5%提高到82.6%和82.5%。lncRNA MALAT1［14］、lncRNA THOR［15］、lncRNA HOTAIR 等［16］也被证实在骨肉瘤患者的循环系统中异常表达，可能成为早期筛查的生物标志物，但上述lncRNA 在循环系统中的特异度及敏感度有待临床进一步验证。

4 lncRNA 对骨肉瘤治疗的影响

4.1 致癌lncRNA 与抑癌lncRNA研究表明，lncRNA 能够在骨肉瘤的启动与进展过程中发挥正向或负向调控作用。通过采集骨肉瘤组织与癌旁组织或不同分期的骨肉瘤组织等临床标本进行定量聚合酶链反应分析，研究目标lncRNA 的表达增量，并结合生物信息学结果进行比对，然后上调或敲降lncRNA 的表达增量，通过细胞恶性生物学特性检测及动物肿瘤接种实验验证其作用。由此，通过临床、细胞、动物3 个层次相互验证，能够系统全面地阐明骨肉瘤相关lncRNA 的作用。

依据在骨肉瘤调控中发挥的正向或负向作用，lncRNA 可分为致癌lncRNA 与抑癌lncRNA。能促进细胞增殖、迁移和侵袭能力及转移过程，抑制细胞凋亡，促进肿瘤发生发展的lncRNA 被称为致癌lncRNA［17］。DUAN 等［14］发现lncRNA MALAT1在骨肉瘤组织及细胞中表达均升高，其高表达常见于肿瘤体积大、临床分期高及合并远处转移等情况，并证实MALAT1 可能通过调节miR-34a/CCND1轴促进骨肉瘤的细胞增殖。ZHANG等［18］也证实了lncRNA MALAT1 在骨肉瘤中的致癌作用，认为可能通过RAC1/JNK 信号通路发挥作用。lncRNA THOR 在骨肉瘤组织中可以检测到，但在癌旁组织中却无法检测到，它可能通过协同IGF2BP1 参与肿瘤的生长［15］。lncRNA PANDA 在骨肉瘤组织中过度表达，促进骨肉瘤细胞U2OS 的增殖、迁移和侵袭，这一过程可能是通过抑制p18 的转录，诱导细胞周期G1 期向S 期转换完成的［19］。REN 等［20］发现lncRNA FOXD2-AS1 在骨肉瘤组织中的表达水平明显高于正常组织，并通过募集具有组蛋白甲基转移酶活性的EZH2，抑制抑癌基因p21表达，促进骨肉瘤的增殖、迁移和侵袭。lncRNA HOTAIR［16］、lncRNA host2［21］、lncRNA snhg1［22-23］、lncRNA ak093407［24］等也被证实能够促进骨肉瘤的启动与进展。

能抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力及转移过程，促进细胞凋亡，抑制肿瘤发生发展的lncRNA 被称为抑癌lncRNA。CHE等［25］发现lncRNA RAB11BAS1 在人骨肉瘤中明显下调，并与转移和预后不良相关，RAB11B-AS1 通过抑制RAB11B 的表达来阻止骨肉瘤的进展。QU 等［26］发现lncRNA WWOXAS1 在骨肉瘤组织中下调，当其过表达时，可以抑制了骨肉瘤细胞的恶性生物学特性。lncRNA LET［27］、lncRNA GAS5［28］、lncRNA CASC2 等［29］也被证实属于骨肉瘤抑癌lncRNA。骨肉瘤相关的lncRNA 的作用与分子机制的阐明，可能有助于确定骨肉瘤的治疗靶点，为相关靶点应用于临床转化医学奠定了理论基础，为临床新型药物的研发提供了科学依据。

4.2 lncRNA对骨肉瘤化疗耐药性的影响与单纯的手术方法相比，联合新辅助化疗的多模式治疗极大的提高了骨肉瘤患者的5年生存率，从10%～20%提高到60%［30］，而化疗耐药往往是另外40%患者预后不良的重要因素。因此，研究lncRNA 在骨肉瘤化疗耐药中的机制，改善化疗耐药性，可能成为提高骨肉瘤生存期的新方向。ZHU 等［31］利用基因芯片技术，筛选出3 465 个骨肉瘤耐药细胞株相关lncRNA，其中1 761 个表达升高，1 704 个表达下降，进一步研究确定了部分lncRNA 影响骨肉瘤细胞对药物的敏感性，与ABCB1、HIF1a 和FOXC2 基因的表达调控密切相关。康宇翔等［32］发现lncRNA HIT 通过正调控Snail 蛋白水平，抑制E-cadherin 的转录活性，进而介导骨肉瘤细胞的顺铂抵抗。ZHANG 等［33］发现lncRNA ODRUL 可以上调经典的耐药相关基因ABCB1，增加骨肉瘤对阿霉素的耐药性，抑制癌细胞的凋亡。lncRNA CTA［34］可以通过抑制细胞自噬提高骨肉瘤组织对阿霉素的敏感性。由此可知，lncRNA在骨肉瘤化疗耐药中起到关键作用，通过lncRNA 的靶向调节，可能会逆转化疗耐药，进而极大地提高患者的临床生存期，但尚需进一步研究探索从而安全地应用于临床。

5 lncRNA 辅助骨肉瘤临床预后评估

研究发现，lncRNA 表达与临床预后存在相关关系。REN 等［20］通过对TCGA 数据库分析及临床标本研究，发现FOXD2-AS1 高表达常见于肿瘤体积大，临床分期晚的患者，这类患者生存期短，预后差。ZHANG 等［35］研究发现CBR3-AS1 在骨肉瘤中过表达，降低E-cadherin 水平，促进肿瘤的转移，并且与骨肉瘤的大小和转移相关，是骨肉瘤预后不良的独立危险因素。业已证实，HOST2［36］、XIST等［37］也反映了骨肉瘤恶性程度较高，预后不良。通过明确lncRNA 与临床预后的相关关系，可以优化临床治疗方案，为手术和化疗的介入治疗的时机提供科学依据。

6 总结与展望

近年来，骨肉瘤的临床治疗遭遇瓶颈，治疗效果进入平台期。随着分子生物学技术的快速发展和应用，lncRNA 的分子机制不断被研究与阐明。相关lncRNA 不仅可以辅助骨肉瘤的早期诊断和预后评估，还调控其生物学特性和化疗耐药性，有望成为新的治疗靶点。但是，lncRNA 的研究目前也面临着一些挑战，比如：（1）lncRNA 数量巨大，功能及作用机制存在多样性；（2）难以单纯通过lncRNA 的序列来预测其功能；（3）目前尚未被特征化标记的lncRNA 可能编码关键的的蛋白质或多肽，影响目标lncRNA 的功能研究。尽管困难重重，但lncRNA 仍被认为是肿瘤研究领域的“明日之星”，探索其对骨肉瘤的影响及分子机制，有利于骨肉瘤高危人群筛查、降低发病率和病死率及改善预后和提高生存率，为临床诊疗提供新思路、新方法。