检测食品中汞、镉、铅、砷等重金属离子的固相荧光传感器

王 洋，熊金恩，李 壹，熊晓晖

(南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800)

目前重金属离子的检测可以通过许多仪器分析方法来实现，如石墨炉原子吸收光谱法(AAS)、比色法、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)和荧光分光光度法等[1]，但是这些技术的主要缺点是仪器一定程度上笨重且昂贵，操作复杂费时，相关程序繁琐，不能快速检测。荧光分子探针技术恰好弥补了这一缺点，但仍然需要开发具有改进性质的重金属离子荧光分子探针，例如具有实际样品检测的可行性，对有毒有害重金属一步广谱筛查的能力，多次循环使用等性能的新型荧光分子探针。

用于实时响应、高选择性、高灵敏度检测中性和离子物质的荧光化学传感器相关技术是一个非常重要的研究领域[2]。近十年来，荧光传感器技术日益更新，传感器也具有了更优秀的灵敏度和更广的适用范围[3-4]。研究者们对于将荧光化学传感器应用于检测实际样品中重金属离子产生了极大兴趣[5-7]。如今，针对感知、检测重金属或过渡金属离子，传感器技术更加偏向于形态固相载体化[8-12]方向发展。如Jia等[13]利用卟啉修饰的功能性水凝胶，能对Cu2+、Zn2+、Pb2+、Co2+、Hg2+和Ni2+等重金属离子快速显色反应，这种新型传感器水凝胶具有高强度、非常突出的抗压性，有很大潜力应用于重金属离子痕量分析和一步可循环检测金属离子。与其他荧光性质的材料相比，卟啉用来检测重金属具有特殊的优势，因为4个吡咯环构成的大π键使得卟啉具有相对较大的平面刚性结构，这为识别重金属离子提供了一个大平台，其本身就是荧光染料，且具有高热稳定性和力学稳定性[6]，在识别重金属时，中间氮原子会与金属络合形成配位键，荧光猝灭，会产生鲜明的颜色变化[14]。

5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)对重金属汞、镉、铅和砷等均有选择性。聚苯乙烯微球具有巨大的比表面积[15]，可参与某些特殊反应、附加特殊功能基团，在生物、食品和化工等领域获得广泛应用[16]。本文中，笔者在聚苯乙烯微球表面修饰上TCPP，制得可重复使用、环境友好型、具有初步筛查食品中汞、镉、铅及砷含量等性能的卟啉基固相荧光传感器(图1)。

图1 PS-TCPP检测金属离子的机制Fig.1 Schematic representation of PS-TCPP for detecting metals

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂

甲醇、NaOH、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，国药集团化学试剂有限公司；氯甲基聚苯乙烯树脂(PS-CL)，东京化成工业株式会社；TCPP、氯化铯，麦克林试剂(上海)有限公司；硝酸、乙腈，西陇化工股份有限公司；重金属标准试剂(Ag、Pb、Cd、As、Hg、Cr)，国家有色金属及电子材料分析测试中心。

1.2 主要实验仪器

ZF-20D型暗箱式紫外分析仪，上海宝山电光仪器厂；Cary 60型UV-Vis紫外分光光度计，安捷伦科技有限公司；78-1型磁力加热搅拌器，上海司乐仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；RF5301PC型荧光分光光度仪,日本岛津；移液枪，宝予德(中国)有限公司；Nicolet iS5型傅里叶变换红外光谱仪，美国赛默飞公司；Sigma 300型扫描电子显微镜，德国Zeiss公司。

1.3 卟啉基固相荧光传感器的合成

化合物TCPP-Na的合成：将TCPP(0.15 g，0.2 mmol)放入圆底单口烧瓶，加入25 mL甲醇于60 ℃磁力搅拌，加热至回流，再加入NaOH(0.02 g，0.5 mmol)，继续加热反应1 h，反应结束后冷却至室温，旋蒸，去除溶剂，并于60 ℃将产物烘干，收集得化合物TCPP-Na。

固相荧光传感器PS-TCPP的合成(图2)：在圆底烧瓶中依次加入TCPP-Na(0.1 g，0.15 mmol),25 mL无水DMF,氯化微球PS-CL(0.3 g，0.6 mmol),氯化铯(14 mg，0.08 mmol),磁力搅拌在80 ℃反应36 h，反应结束后过滤洗去多余溶剂，得粗产物微球。将粗产物索氏抽提36 h，得紫红色PS-TCPP。

图2 PS-TCPP的合成路线Fig.2 Synthetic route of probe PS-TCPP

1.4 PS-TCPP的光谱性能测定

1.4.1 待测溶液的配制

TCPP储备液。TCPP溶解于DMF中，配制成1.0 mmol/L的标准溶液，4 ℃保存备用，荧光分析实验时将储备液用超纯水稀释至所需浓度。

金属离子储备溶液[17]。用相应的金属离子盐试剂配制10 mmol/L的Sn2+、Fe2+、Al3+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+和Ba2+储备水溶液，100 μmol/L的Ag+、Pb2+、Cd2+、As2+、Hg2+和Cr3+储备溶液，荧光分析实验时用乙腈稀释至目标浓度。

1.4.2 荧光传感器的光谱性能测定实验方法

1)探针母液荧光分析。在10 mL比色管中加入10 μL探针母液，用超纯水定容，摇匀后放置4 min。室温下，取3 mL试液于1 cm普通石英比色皿中测量紫外-可见吸收光谱，做离子选择性实验，激发和发射波长分别为590和652 nm，狭缝5 nm，带宽5 nm。

2)固相荧光传感器红外分析。取约1 mg PS-TCPP粉末置于红外仪的金属凹槽内，电子探头下，进行红外光谱扫描。

3)固相荧光传感器荧光分析。取约0.4 mg PS-TCPP加入超微量石英比色皿中，加入200 μL乙腈，再分别加入不同量的金属离子储备液，静置2 min后，室温下进行荧光分析实验。激发波长为590 nm，发射波长为652 nm，狭缝5 nm，带宽5 nm。

1.4.3 食品样品的处理[18]

采用干法灰化法，分别称取0.2 g糯米粉、鱿鱼和猪头肉等食品样品放入坩埚内，预灰化30 min后在马弗炉内500 ℃加热4 h，取出灰化后样品，加入0.5%HNO3200 μL，再用乙腈定容。

2 结果与讨论

2.1 TCPP的选择性

为了考察探针TCPP对金属离子的选择性识别性能，进行光学实验，结果如图3(a)所示。由图3(a)可知，探针TCPP中加入100倍浓度的碱金属离子、碱土金属离子和10倍浓度的过渡金属离子后，除Na+外均产生了荧光猝灭现象。探针中加入Pb2 +、Cu2+、Cd2+、Fe2+、Ag+和Hg2+后，荧光强度明显下降。由此说明，探针卟啉TCPP有检测低浓度重金属离子的能力。

2.2 TCPP的镜像实验结果

探针的DMF溶液的紫外可见吸收光谱图和荧光发射谱如图3(b)所示。由图3(b)可知，其吸收峰位于414 nm，在514、548、591和648 nm处是探针卟啉的4个特征峰。当探针在590 nm受激发，其最大发射峰出现在644 nm处，探针的荧光谱图和吸收光谱图呈镜像对称，与紫外吸收光谱相比，斯托克斯位移了230 nm。

图3 DMF体系中探针TCPP的紫外可见吸收光谱和 荧光发射光谱Fig.3 UV-visible absorption spectrum and fluorescence emission spectrum of probe TCPP inDMF system

2.3 合成产物红外谱(IR)与扫描电子显微镜(SEM)分析

图4 红外图谱Fig.4 IR spectrum

与PS-CL相比，SEM图谱显示出聚苯乙烯微球宏观形态和表面微观变化(图5)。由图5可知，PS-CL全部由C、H、CL组成，TCPP含有N、O等元素，PS-TCPP比PS-CL多出了N和O的能谱峰，表面颗粒变多、纹理变少，表明TCPP已经固载上了PS-CL表面。

2.4 PS-TCPP的响应时间

取0.4 mg固相荧光传感器PS-TCPP加入微量石英比色皿中，加入200 μL乙腈，再加入5 μL 5 μmol/L Hg2+乙腈溶液，室温下进行荧光实验。激发波长为590 nm，发射波长为652 nm，观察5 min内探针的荧光响应情况，结果如图6所示。由图6可知：未加入Hg2+时，PS-TCPP的荧光强度基本不受时间影响；加入Hg2+后，2 min内体系的荧光强度逐渐降低，2 min后体系的荧光强度基本趋于恒定，可知探针PS-TCPP对重金属离子的荧光响应时间为2 min。

谱图1为PS-CL的能谱图，谱图2为PS-TCPP的能谱图图5 PS-TCPP的扫描电镜图与能谱图Fig.5 Scanning electron microscope and energy spectrum of PS-TCPP

图6 探针PS-TCPP对重金属Hg2+的荧光响应-时间曲线Fig.6 Fluorescence response of probe PS-TCPP to Hg2+ at different time

2.5 溶液基质中硝酸对荧光强度的影响

采用的重金属国家标准样品溶剂中含有HNO3，用PS-TCPP传感器对稀释的重金属国家标准样品(单标)、与单标重金属稀释溶液含同浓度硝酸的乙腈溶液进行荧光分析，结果如图7所示。由图7可知：加入重金属离子铅溶液后，PS-TCPP由深红色转变为绿色；扣除HNO3对PS-TCPP的影响后，重金属Hg2+、Pb2+等均对PS-TCPP仍然具有明显的猝灭效果。

图7 HNO3基质对传感器PS-TCPP荧光强度的影响Fig.7 Effects of nitric acid matrix on fluorescence intensity of sensor PS-TCPP

2.6 荧光传感器PS-TCPP的选择性

为了研究固相荧光传感器PS-TCPP对Hg2+、Pb2+等金属离子的选择性识别能力，向传感器体系中分别加入同浓度的Hg2+、Pb2+、Cd2+、As3+及100倍量的碱金属离子(Na+、K+)、100倍量的碱土金属离子(Mg2+、Ca2+、Ba2+)和10倍量的过渡金属离子(Cu2+、Cr3+、Ni2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+和Ag+)，使最后所有样品体系中HNO3浓度相同，激发波长均为590 nm，得不同金属离子最大发射波长652 nm处荧光猝灭程度，结果见图8。由图8可知，在同样实验条件下，以Hg2+猝灭强度为100%，Pb2+、Cd2+和As3+的猝灭强度分别是45%、53%和52%，其他的金属离子猝灭强度相对较小，干扰较小。综上，PS-TCPP对Hg2+、Pb2+、Cd2+和As3+这4种有毒有害重金属离子均具有选择性。

图8 荧光传感器PS-TCPP的荧光性能Fig.8 Fluorescence properties of fluorescence sensor PS-TCPP

2.7 实际样品检测

以空白样品基质检测PS-TCPP的实际样品应用性能，配制不同浓度的Hg2+溶液，利用PS-TCPP进行荧光测定。以Hg2+浓度为横坐标，荧光响应强度为纵坐标，分别得到米粉、鱿鱼和猪头肉3种样品基质的标准曲线及线性方程。

米粉样品基质标准曲线方程为I=-470c+293，R2=0.992 6。在0.1～0.45 μmol/L浓度范围内，Hg2+浓度与荧光强度线性关系良好，相关系数R2>0.99，检出限为0.16 μmol/L (LOD=3σ/N[19]；σ为空白试样最大发射波长处荧光强度的标准偏差；N为线性范围内标准曲线的斜率)，满足定量分析需要。

鱿鱼样品基质标准曲线方程为I=-255c+293，R2=0.989 9。在0.125～0.6 μmol/L浓度范围内，Hg2+浓度与荧光强度线性关系良好，相关系数R2>0.98，检出限为0.30 μmol/L。

猪头肉样品基质标准曲线方程为I=-399c+424,R2=0.992 8。在0.1～0.65 μmol/L浓度范围内，Hg2+浓度与荧光强度线性关系良好，相关系数R2>0.99，检出限为0.19 μmol/L。

2.8 回收率实验

除了以空白样品基质检测PS-TCPP的实际样品应用性能之外，为评估实际食品样品应用能力，还需要加标回收实验。以未添加重金属Hg2+的实际样品作为空白对照，准确称取0.2 g猪头肉、糯米粉和鱿鱼样品，分别添加3个水平(0.2、0.5和1.0 μmol/L)的Hg2+标准溶液，搅拌混匀，再按照建立的方法进行回收率实验。空白样品、金属离子添加浓度及回收率见表1。

表1 食品样品中Hg2+的添加回收率实验Table 1 Recovery experiment of Hg2+ in food samples

由表1可知：米粉基质中，添加回收率为70%～121%，相对误差为10%～30%；鱿鱼基质中，添加回收率为94%～125%，相对误差为2%～25%；猪头肉基质中，添加回收率为86%～110%，相对误差为3%～14%。基本满足痕量分析要求，表明PS-TCPP具有复杂食品样品基质重金属离子检测的可行性和实用性。国标方法采用的原子荧光光谱法是精密的仪器检测方法，而本研究制备的固相荧光传感器是一种快速检测方法，暂未达到精密仪器方法的检测精度水平。

2.9 固相荧光传感器PS-TCPP的重复性

由于荧光传感器响应的可逆性决定传感器是否能够再次回收利用，利用EDTA溶液考察PS-TCPP的可逆响应情况，结果如图9所示。由图9可知：向(PS-TCPP-Pb2+-乙腈溶液)体系中，数次逐滴加入EDTA水溶液(0.25 mmol/L)，并记录荧光谱图，可发现PS-TCPP-Pb2+-乙腈溶液体系加入EDTA络合剂后，呈现出荧光增强的趋势，荧光强度几乎恢复到空白PS-TCPP的强度；用乙腈溶液洗涤上述使用过的PS-TCPP数次，重复Pb2+荧光滴定和EDTA溶液滴定步骤，传感器PS-TCPP的荧光强度随之产生猝灭、恢复荧光强度的效果。因此，PS-TCPP具有可重复使用的潜力。

图9 纯乙腈体系中PS-TCPP的重复利用实验Fig.9 Repetitive experiment of PS-TCPP in CH3CN

3 结论

设计合成了一种卟啉基固相荧光传感器PS-TCPP，通过红外谱图、SEM图及能谱图等结构确证。实验表明，PS-TCPP结合一定浓度汞等重金属离子后，微球由深红色转变为绿色，以Hg2+的猝灭强度为100%，Pb2+、Cd2+和As3+的猝灭强度分别是45%、53%和52%，其他的金属离子干扰较小，PS-TCPP对Hg2+、Pb2+、Cd2+和As3+等有毒有害重金属离子均具有选择性，可同时检测Hg2+、Pb2+、Cd2+和As3+等有毒有害重金属离子。应用于实际样品检测时，Hg2+、Pb2+、Cd2+和As3+等浓度与荧光强度线性关系良好，相关系数R2>0.9，满足定量分析需要，有重复检测食品中汞、镉、铅和砷等重金属离子的潜力，有望作为食品快速检测试剂。