MUS81-EME1维持基因稳定性作用研究进展

贺鸿桂，徐祖敏

广东医科大学附属医院，广东湛江524000

DNA是生物遗传信息的主要载体，因此保持DNA的完整性和稳定性对细胞的延续及发挥正常生理功能具有非常重要的意义。基因组DNA面临各种各样的损伤，这些损伤如不能及时、正确修复，可能导致基因组不稳定甚至肿瘤的发生。为了维持基因组的稳定性，生物在进化过程中逐步建立起完整而精密的损伤应答系统。结构特异性核酸内切酶在DNA复制、修复、重组中发挥了重要的作用，MUS81-EME1是结构特异性核酸内切酶之一[1]。在哺乳动物细胞中MUS81与EME1形成异源二聚体MUS81-EME1。MUS81和EME1属于XPF内切酶家族，包含ERCC4核酸酶结构域和串联螺旋-发夹-螺旋(HhH)2结构域。MUS81中的ERCC4核酸酶结构域具有催化活性，EME1缺少发挥催化活性的关键氨基酸，因此被认为是一个调节亚基[2,3]。MUS81-EME1复合物被证明可以裂解多个支链DNA底物，如DNA 3′游离末端、复制叉和带切口的霍利迪连接(HJ)。相关研究表明，MUS81-EME1与其他核酸内切酶(如SLX1-SLX4和XPF-ERCC1)形成多聚体从而增强其作为分解酶的活性[4]。MUS81-EME1的活性以细胞周期依赖的方式受到严格的调控。人类MUS81-EME1中EME1可被细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK1)和PLK1磷酸化修饰，这种修饰能增强其拆解HJ的能力[5]。基于MUS81-EME1上述生物学功能特点，其在同源重组修复、链间交联(ICL)修复、促进染色体脆弱位点(CFS)表达中发挥了重要的作用，还能作用于癌基因激活后复制应激中出现的反向复制叉，起到了潜在致癌作用。现就MUS81-EME1维持基因稳定性作用的研究进展综述如下。

1 MUS81-EME1在同源重组修复中的作用

DNA复制需要亲本DNA双链被解螺旋酶解旋，形成了称为复制叉的分支DNA结构，再以每条亲代DNA单链为模板进行DNA的复制。DNA在复制过程中遇到许多障碍，阻碍复制叉进程。复制叉的恢复高度依赖于同源重组，并且常涉及姐妹染色单体之间的相互作用，形成分支DNA中间体，特别是HJ[6]。HJ是姐妹染色单体之间形成共价连接的四链DNA连接，既往研究表明其主要来源于双链断裂的同源重组修复[7]。因此，尽管HJ的产生有助于DNA高效修复，但它会干扰正常的染色体分离，此类重组中间体必须在有丝分裂前被清除，以使DNA在子细胞中均匀分布。一个未经处理的HJ可能导致染色体不分离和非整倍体，这与恶性肿瘤的发生有关。相关研究发现了两种不同的HJ处理机制，即溶解和分解。溶解拓扑异构酶，产生非交叉产物产品；分解反应由高度特化的核酸酶催化，分解HJ产生交叉和非交叉产物[8～11]。

人体细胞中涉及HJ分解的核酸酶为MUS81-EME1、SLX1-SLX4、GEN1，这些酶是保证染色体分离、维持基因组稳定性及细胞活力所必需的。在这些核酸酶中，MUS81-EME1是切割HJ的主要核酸酶[4, 12]。研究显示，MUS81-EME1在体外不能有效地裂解完整的HJ，但MUS81-EME1可与另一种结构选择性内切酶SLX1-SLX4在细胞G2/M期相互作用形成SLX-MUS全酶，增强了其对HJ的裂解能力[8,11]。最新研究发现，MUS81-EME1、SLX1-SLX4和XPF-ERCC1形成全酶复合体(SMX)，比三种核酸酶单体能更有效地解决复制和重组中间产物。在SMX中，在XPF-ERCC1刺激下，SLX4-SLX1和MUS81-EME1配合，用于HJ裂解；SMX通过松弛底物特异性激活MUS81-EME1，使复制叉和皮瓣结构发生裂解；激活涉及MUS81的保守的N端HhH区，介导切口位置选择和SLX4结合。XPF-ERCC1对HJ的分解不是必需的，其可能促进了SMX内部的结构转变，从而促进了催化的最佳底物结合，但它在复合物中的确切作用需要进一步研究[4]。

MUS81-EME1对HJ的作用受细胞检查点的调控。MUS81-EME1中EME1在G2/M期同时被CDKs和PLK1修饰，EME1被磷酸化，这种修饰能增强其处理HJ的能力[5]。CDK1的活性在有丝分裂开始时达到峰值，它触发了MUS81-EME1与二级结构选择性内切酶SLX1-SLX4的细胞周期特异性结合，形成SLX-MUS全酶[8,10,11]。最新研究发现，人类细胞中MUS81-EME1复合物的生物学功能受到CK2的正向调节，CK2可磷酸化MUS81亚基中的丝氨酸87(S87)；该研究证实，人类的MUS81-EME1复合物在G2期末和有丝分裂早期变得活跃，在S期表达非常低或检测不到，MUS81复合体需要在正常复制期间失活，说明MUS81-EME1的活性受细胞周期蛋白和复制检查点的调控[13]。

上述研究表明，未被处理而积蓄的HJ会阻碍染色体分离并危及细胞的生存能力，MUS81-EME1可分解同源重组产生的中间产物HJ，促进DNA的修复及染色体的正确分离，进而维持基因组的稳定性。

2 MUS81-EME1对CFS的作用

基因组的特定区域如普通型CFS在S期难以复制，这些位点招募DNA损伤反应蛋白形成核灶，在中期染色体中形成可见缝隙或断裂的倾向。在大多数个体中，常见的CFS形成断裂或缺口(通常称为CFS表达)，这些位点中有200多个已在人类基因组中被识别[14]。虽然CFS表达并不是由任何单一原因引起的，但它们的不稳定性可能是由于复制叉停止、晚期DNA复制中间体的积累、重复的DNA序列、缺乏复制起点或复制与转录机制之间的冲突等原因造成的。CFS在细胞周期的S期后期复制，在轻度复制应激条件下甚至可能更晚。CFS的不稳定性在某些恶性肿瘤的发病中起着重要作用，因为在肿瘤发生过程中发生的许多染色体易位和重排都起源于CFS[15,16]。现已发现多个抑癌基因位于CFS区域，在恶性肿瘤中经常被删除，提示CFS表达(即其在中期的明显断裂)可能是肿瘤发生的驱动因素[17]。许多CFS可能在细胞进入有丝分裂前不能完全复制，这将阻碍姐妹染色单体在有丝分裂中的忠实分离，并对基因组的稳定性构成重大威胁。MUS81-EME1和XPF-ERCC1等结构特异性核酸酶在复制后期中间产物上的核溶解切口被认为用于姐妹染色单体分离[18,19]。MUS81-EME1在有丝分裂早期定位于CFS，切割DNA链，解决复制中间产物及防止后期桥的形成；当MUS81-EME1缺失时，染色体-大桥、微核、超细后期DNA桥的数量都会增加，提示CFS位点的分裂失败将导致姐妹染色单体分离的失败。虽然在不完全复制的CFS区域的复制中间产物裂解足以使染色单体分离，但这些染色单体仍处于不完全复制状态。MUS81-EME1在有丝分裂早期对CFS的裂解促进了CFS区域的有丝分裂DNA合成(MiDAS)，这是表达CFS所必需的[20]。CFS的表达来自于MiDAS位点染色质的去中心化，而不是DNA断裂。目前认为，以依赖于MUS81-EME1的方式发生的CFS断裂或缝隙有助于促进该区域的稳定性。

3 MUS81-EME1对ICL修复的作用

ICL是一种高毒性的DNA损伤，为共价连接DNA双链[21]。ICL诱导剂是肿瘤治疗中常用的药物，包括丝裂霉素C、氮芥、顺铂等。然而，这些药物的疗效被肿瘤细胞产生的耐药性所限制。研究发现，肿瘤细胞对不同ICL诱导剂的交叉抗性可能在接触一种诱导剂后产生，这表明肿瘤细胞具有ICL修复机制，并提示该机制在耐药细胞中增强。早期的哺乳动物细胞实验表明，哺乳动物对顺铂、丝链霉素等链间交联剂很敏感，而产生ICL诱导的双链断裂(DSB)需要MUS81-EME1，提示MUS81-EME1在ICL修复起到了切开切口的作用[21]。随后有研究表明，MUS81-EME1突变细胞对ICL敏感，但不及XPF-ERCC1突变敏感[22,23]，这说明MUS81-EME1在ICL修复中起次要作用。随着研究的深入，发现SLX4与XPF-ERCC1和SLX1的结合形成的XPF-ERCC1-SLX4-SLX1复合体在ICL修复中的作用至关重要，这可能是通过将XPF-ERCC1-SLX4-SLX1复合体引入损伤位点来实现的[8]。而MUS81与SLX4的相互作用对于ICL的修复并不是必需的，即MUS81只用于特殊情况，也就是当ICL的3′端包含一个真正的3′ flap结构时。目前认为MUS81-EME1对ICL的修复确实起到了作用，但其作用只是众多机制的一部分。

4 MUS81-EME1对DNA复制中间体的作用

复制叉在复制过程遇到DNA损伤时会引起复制叉的停滞或阻滞，复制叉的停滞和阻滞可导致不积极参与DNA合成的复制中间体(RIs)的积累。早期有学者用复制抑制剂HU和APT处理小鼠，发现MUS81响应了复制抑制剂诱导的复制叉停滞，参与了双链DNA断裂的形成，并且可重新启动复制叉；在低剂量暴露于这些复制抑制剂的情况下，缺乏MUS81的细胞活力降低[24]。该研究表明MUS81-EME1可以处理这些停滞的复制叉，并可促进随后的DNA复制，从而促进细胞的存活。在乳腺癌相关蛋白2(BRCA2)缺陷型细胞中，复制叉重新启动需要部分切除，退化的复制叉要依赖于MUS81的切割[25]。该观点与后来的断裂诱导复制有着一致性，即在断裂诱导复制修复途径中，将阻滞的复制叉转化为短暂的DNA双链断裂，后者随后作为依赖于同源重组的复制沿断裂诱导复制途径重新启动的底物[26]。在遭受各种内源性和外源性复制应激的人类细胞中，MUS81-EME1始终可以促进染色体断裂、复制重新启动及提高细胞生存能力[27,28]。

5 MUS81-EME1在癌基因诱导的复制应激中的作用

DNA复制应激被用于广泛定义DNA复制障碍，包括DNA复制叉的停滞和崩溃。癌基因激活可引起复制应激，这是肿瘤细胞的共同特征。复制叉反转是对复制停滞的一种响应，最初被认为是病理性的，其实对停滞的复制叉可起到保护作用。一项研究显示，在癌基因激活后引起的复制应激中，反向复制叉是最常见的非典型复制中间体[29]。反向复制叉的定义是将一个典型的复制叉(三向连接)通过两个新合成链的协调退火和模板链的再退火转变为生成类似HJ的四链DNA复制中间体。该研究采用电子显微镜观察致癌基因细胞周期蛋白E(CycE)和CDC25A过表达后诱导的反向叉，发现在敲除MUS81后反向叉水平升高更明显，提示反向复制叉可能被MUS81-EME1转化成为DSB，作为复制染色体断裂的前体。而MUS81在CycE过表达时引起的断裂能增强细胞的存活能力；CDC25A过表达时，细胞则大量死亡。CycE过表达与CDC25A过表达不同之处在于细胞周期检查点是正常的，这表明，在细胞周期检查点正常的情况下，刻意的复制叉切割可以帮助细胞克服内源性复制应激。由此推测，癌前病变的细胞对结构特异性核酸酶如MUS81-EME1具有更高的依赖性，这为以MUS81-EME1为靶点的肿瘤治疗提供了可能。有学者就WAN蛋白对复制应激的影响进行研究，发现在经历了癌基因诱导的复制应激细胞中形成的DSB也是依赖于MUS81。实验中显示，无论是野生型细胞还是WRN敲除的细胞，在CycE过表达后，MUS81下调会抑制染色单体破坏，这一发现可能表明，由癌基因导致的复制应激引起的染色体损伤来自于MUS81对受干扰复制叉的不定期处理[30]。另有研究显示，FBH1和MUS81-EME1介导的DNA DSB在长时间的复制应激后会触发检查点信号高表达和p53信号通路激活，诱导细胞凋亡，虽不能促进细胞的恢复，但可能帮助清除高水平复制应激的细胞，抑制病理遗传变化的产物[31]。有研究报告，RAD51过表达的肿瘤细胞中有频繁的复制叉停滞或反转。上调的RAD51 RNA与编码两个已知HJ去除蛋白(EME1和GEN1)RNA表达之间存在很强的相关性。数据表明，表达增加的EME1可能有助于清除反向复制HJ，即EME1对肿瘤细胞中反转复制叉的处理实际上促进了肿瘤细胞的DNA复制，起到了潜在致癌作用[7]。上述这些关于癌基因诱导的复制应激的研究表明，MUS81-EME1能作用于癌基因激活后复制应激下的反向复制叉，或是肿瘤细胞中的反向复制叉，并且促进反向复制叉的断裂，形成DSB。MUS81-EME1对反向复制叉作用的程度与细胞复制检查点和周期蛋白的调控密切相关。

综上所述，MUS81-EME1能有效去除复制和重组中间产物，其高效分解对染色体分离至关重要。依赖于MUS81-EME1发生的CFS断裂或缝隙可以很好地促进这些区域的稳定性，在ICL修复中也有一定的作用。因此，MUS81-EME1是维持基因组稳定性所必需的。MUS81-EME1功能的缺失或突变会引起相关疾病，且与肿瘤易感性密切相关。有研究发现中国南方女性EME1 Thr变异可增加患乳腺癌的风险和促进乳腺癌早发[32]。此外，MUS81-EME1还参与了DNA损伤修复过程，其功能的变化可能影响肿瘤细胞的放化疗敏感性。有学者在人结肠癌细胞系HCT116中发现，人类细胞中EME1对DNA交联剂引起的损伤有抵抗作用，原因可能是DNA交联剂可造成复制叉停滞，而MUS81-EME1能修复和重新启动停滞的复制叉从而出现对DNA交联剂的耐受[33]。近些年癌基因诱导的复制应激相关研究提示，在癌前病变的细胞中，MUS81-EME1能修复损伤的DNA、促进细胞存活，或帮助清除高水平复制应激的细胞、抑制病理遗传变化，在长远上促进了基因组的稳定及抑制细胞癌变[29，31]。总之，大量研究证实了MUS81-EME1在同源重组修复、ICL修复、促进CFS区域稳定性方面的生物学功能，未来还需进一步探讨和研究MUS81-EME1在恶性肿瘤中的具体作用机制、对肿瘤发展及预后的影响，MUS81-EME1在肿瘤治疗中的探索也有望进一步展开。