肺癌患者血浆甲基化SHOX2、RASSF1A基因的检测分析

唐华，廖洪春，岑玉兰，廖光付，唐际富

1广西科技大学第二附属医院，广西柳州 545006；2广西壮族自治区龙潭医院；3广西壮族自治区胸科医院

肺癌是常见的呼吸系统恶性肿瘤，也是全球范围内癌症死亡的首要原因，严重威胁人类健康[1]。肺癌的治疗包括手术治疗、化疗及分子靶向治疗等，但晚期肺癌患者预后较差[2]。肿瘤的发生与原癌基因的激活、抑癌基因的失活有关，而肿瘤相关基因的表观遗传学修饰如甲基化、乙酰化、糖基化等是调控基因表达的重要机制。研究[3,4]表明，通过检测患者外周血、支气管肺泡灌洗液(BALF)及癌组织标本中抑癌基因甲基化情况，有助于肺癌的早期诊断。但支气管镜下活检获取的癌组织标本可能会因取材位置不当，出现假阴性的结果。BALF虽能大面积冲洗收集脱落的肿瘤细胞，但仍需支气管镜下操作，具有一定的创伤性。而血浆标本容易获取，检测血浆标本中游离DNA的异常改变，具有较高的临床价值。矮小同源盒基因2(SHOX2)基因位于3q25.32，是同源盒基因家族的成员，编码蛋白包含DNA结合域，作为转录调节因子调控基因表达，影响组织器官的生长发育及分化。SHOX2基因是双向调控基因，在特定组织类型中发挥抑癌基因的作用，其甲基化沉默与肺癌关系密切，甲基化SHOX2基因检测有望成为肺癌早期筛查的指标[5]。RAS相关区域家族1A(RASSF1A)基因位于3p21.31，是典型的抑癌基因，其CpG岛启动子区域的高甲基化失活参与肺癌、结直肠癌等多种癌症的发生发展，检测甲基化RASSF1A基因有可能成为肺癌的诊断治疗新靶点[6]。本研究检测了肺癌患者甲基化SHOX2、RASSF1A基因，并探讨其意义。

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1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月～2019年1月广西科技大学第二附属医院收治的肺癌患者92例(观察组)，男60例，女32例；年龄42～76(53.2±6.7)岁；病理类型：肺腺癌37例，肺鳞癌33例，小细胞肺癌22例；肿瘤分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期33例，Ⅲ期25例，Ⅳ期13例。肿瘤分化程度：高分化21例，中分化36例，低分化35例；伴淋巴结转移40例，无淋巴结转移52例。纳入标准：①经病理学检查明确诊断为肺癌；②均为初次诊治，既往未接受过任何抗肿瘤治疗；③临床病理资料完整。排除标准：①同时合并有感染性疾病，如呼吸系统感染等；②伴其他器官系统恶性肿瘤；③合并严重的心肺肝肾等脏器功能障碍。另选68例肺部良性疾病患者作对照(对照组)，男41例，女27例；年龄43～78(54.6±6.1)岁；疾病类型：肺结核30例，肺炎性假瘤23例，间质性肺病8例，肺结节病7例。患者及家属均知情同意并签字，且本研究经我院伦理委员会审核批准通过。

1.2 血浆、BALF、癌组织甲基化SHOX2和RASSF1A基因检测 采用甲基化特异PCR法。①血浆中甲基化SHOX2、RASSF1A基因检测：所有入选对象入院后术前清晨抽取空腹静脉血约10 mL，2 h以内以5 000 r/min的速度离心10 min，离心半径10 cm，吸取上层血浆，-80 ℃条件下保存待测。采用游离DNA提取试剂盒提取血浆中DNA。DNA的OD260/OD280比值一般为1.7～1.9。应用亚硫酸氢钠修饰基因组DNA，实验步骤严格按照EZ DNA Methylation-Gold Kit说明书进行，将DNA中尚未甲基化的胞嘧啶(C)修饰为尿嘧啶(U)，50 ℃条件下水浴过夜，乙醇沉淀，DEPC水重悬后进行甲基化特异PCR。MS-PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸8 min，共40个循环。总反应体系50 μL，DNA模板10 μL，缓冲液2.5 μL，Taq酶2 U，dNTPs 4 μL，MgCl 4 μL，上游及下游引物各1 μL，PCR结束后琼脂糖凝胶电泳，以去离子水为阴性对照，应用紫外成像分析系统照相。应用Image J软件对甲基化及非甲基化条带的灰度值进行统计，计算甲基化条带/非甲基化条带灰度值比值。根据DNA条带判断结果，甲基化阳性：甲基化引物扩增出目的条带，而非甲基化引物未扩增出目的条带。甲基化阴性：非甲基化引物扩增出目的条带，甲基化引物未扩增出目的条带。②BALF中甲基化SHOX2、RASSF1A基因检测：所有入选对象入院后均接受纤维支气管镜检查，采取BALF，首先向要灌洗的肺段注入2%利多卡因1 mL进行局部麻醉，然后经活检孔向病变肺段注入50 mL生理盐水(NS)，负压吸引回收至瓶子中，重复2次，回收量≥40 mL，将滤液置于离心管，以2 000 r/min速度离心10 min，离心半径10 cm，去上清液，沉淀细胞团用500 μL～1 mL细胞保存液悬浮，转移至1.5 mL的Eppi管，-80 ℃下保存待测。采用细胞基因组DNA抽提试剂盒抽提BALF细胞DNA，抽提DNA后实验步骤同“①”。③癌组织中甲基化SHOX2、RASSF1A基因检测：收集所有入选对象术中新鲜获取的组织标本，置于冻存管中液氮速冻，转运置实验室后-80 ℃条件下保存待测。采用组织基因组DNA抽提试剂盒抽提冰冻新鲜组织中DNA，抽提DNA后实验步骤同“①”。

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2.4 血浆与癌组织、BALF中甲基化SHOX2、RASSF1A基因的一致性 血浆、癌组织、BALF中甲基化SHOX2基因阳性率分别为52.2%(48/92)、59.8%(55/92)、51.1%(47/92)，甲基化RASSF1A基因阳性率分别为55.4%(51/92)、64.1%(59/92)、53.3%(49/92);血浆中甲基化SHOX2基因阳性率与癌组织、BALF中的结果具有良好的一致性，一致率分别为87.3%(48/55)、97.9%(47/48);血浆甲基化RASSF1A基因阳性率与癌组织、BALF中的结果具有良好的一致性，一致率分别为86.4%(51/59)、96.1%(49/51)。

2 结果

2.1 两组血浆甲基化SHOX2、RASSF1A基因阳性率比较 观察组血浆甲基化SHOX2、RASSF1A基因阳性率分别为52.2%(48/92)、55.4%(51/92)，对照组分别为2.9%(2/68)、5.9%(4/68)，两组比较，P均<0.05。

2.2 血浆甲基化SHOX2、RASSF1A基因与肺癌临床病理特征的关系 血浆甲基化SHOX2、RASSF1A基因与肺癌临床病理特征的关系见表1。由表1可知，血浆甲基化SHOX2、RASSF1A基因阳性与肺癌肿瘤分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)。

通过专家法确定发生频度、危害程度、检测难度和维修难度这4个决策指标对应的决策权，分别为：η1=0.18，η2=0.28，η3=0.28，η4=0.26。

2.3 血浆甲基化SHOX2、RASSF1A基因对肺癌的诊断价值 根据ROC，以约登指数最大时，血浆甲基化SHOX2、RASSF1A基因诊断肺癌的最佳截断值分别为1.234、1.379。血浆甲基化SHOX2单独检测诊断肺癌的灵敏度为53.7%、特异度为86.07%、阳性预测值为87.4%、阴性预测值为16.7%、AUC为0.812、95%CI为0.730～0.882，血浆甲基化RASSF1A基因单独检测诊断肺癌的灵敏度为64.1%、特异度为92.1%、阳性预测值为93.7%、阴性预测值为29.8%、AUC为0.748、95%CI为0.671～0.820，两者联合检测诊断肺癌的灵敏度为81.6%、特异度为94.2%、阳性预测值为96.6%、阴性预测值为40.9%、AUC为0.911、95%CI为0.843～0.955。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验；采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血浆甲基化SHOX2、RASSF1A基因对肺癌的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

3 讨论

SHOX2大小约10 kb，又可分为2a、2b及2c三个亚型，在胚胎发育过程中发挥重要调控作用。近年研究发现，肿瘤中SHOX2基因存在异常甲基化的现象，导致基因转录水平表达沉默，影响肿瘤细胞的生物学功能，因此甲基化标记可能是肿瘤诊断的重要标志物[10]。RASSF1A是一种重要的抑癌基因，肿瘤中此基因启动子区CpG岛处高甲基化是导致该基因失活的主要机制，引起肿瘤细胞无限增殖且凋亡抑制[11]。本研究显示，观察组血浆SHOX2、RASSF1A基因甲基化阳性率高于对照组，表明肺癌患者SHOX2基因的甲基化水平升高，但其机制尚不清楚，可能是结合于基因启动子区CpG岛处的转录因子或转录辅助因子异常后，导致甲基化位点暴露，CpG甲基化结合蛋白结合到基因启动子区，促进其甲基化[12]。此外，血浆中甲基化SHOX2、RASSF1A基因阳性与肺癌肿瘤分期、淋巴结转移有关，表明甲基化SHOX2、RASSF1A基因促进肺癌的发生发展，其原因是RASSF1A基因编码的蛋白具有结合Ras蛋白的结构域，并发挥抑制Ras信号传导通路的作用，肿瘤发生时甲基化RASSF1A基因失活，导致肿瘤过度增殖[13]。而SHOX2基因编码蛋白是一种重要的转录抑制因子，甲基化SHOX2基因失活后，下游上皮间质转换等癌基因表达明显上调，促进肿瘤细胞的增殖及转移[14]。

肺癌是最常见恶性肿瘤，发病率为61.86/10万，也是病死率最高的癌症，约50.04人/10万[7]。虽然早期筛查及早期治疗有利于预防甚至治愈疾病，但是多数肺癌症患者发现于中晚期，5年生存率仅17.8%，低于其他大多数癌症[8]。临床上可用于早期诊断肺癌的标本包括血浆、BALF及癌组织活检等，但临床上相较于其他标本，血浆标本易获取，对创伤小，患者容易接受，因此检测血浆标本中肿瘤标志物的表达水平，具有较高的临床价值。抑癌基因如RB转录抑制因子1、磷酸酶和张力蛋白同源物基因等的失活是肿瘤发生的重要原因，抑癌基因的失活涉及多种机制的参与，如基因突变、染色体杂合性丢失等。抑癌基因甲基化是近年来发现的新的调控基因表达的化学修饰方式，是在甲基转移酶介导下，将胞嘧啶装变为5-甲基胞嘧啶，甲基化位点多位于基因5′端的CpG岛处，而多种肿瘤中均存在基因异常甲基化的现象[9]。因而针对基因甲基化的研究可为临床诊断、治疗肿瘤提供指导。

以往文献[5,15]报道，SHOX2和RASSF1A基因异常甲基化有助于肿瘤的早期诊断。本研究显示，单独检测血浆甲基化SHOX2和RASSF1A基因诊断肺癌的灵敏度不高，而血浆甲基化SHOX2和RASSF1A基因联合检测诊断肺癌的灵敏度增加，表明联合检测对肺癌诊断具有较高的价值，有可能成为诊断肺癌的有效辅助工具。有学者报道，如血浆学指标与细胞学检测结合使用，能够弥补细胞学检查中诊断不能明确的情况，诊断肺癌的灵敏度和特异度分别提高至93.0%和94.7%[16,17]。

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临床上对肺癌检测的理想目标是通过检测血液中肿瘤指标观察肿瘤的发生及发展过程。肿瘤患者血浆DNA主要来自肿瘤组织释放入血的DNA，近年来随着基因技术的发展，检测血浆DNA有助于肿瘤的早期诊断及致病基因的检出。而BALF是一种非侵入性诊断标本，易通过纤维支气管镜检查获得，由于其靠近肿瘤细胞，BALF亦可作为检测肿瘤生物标志物的替代手段。本研究对血浆与BALF、癌组织中甲基化SHOX2和RASSF1A基因检测结果进行比较，结果显示血浆与BALF、癌组织中甲基化率具有良好的一致性，表明检测血浆甲基化SHOX2和RASSF1A基因是一种可靠的检测方式。

总之，肺癌血浆甲基化SHOX2、RASSF1A基因水平升高，两指标甲基化阳性与肺癌肿瘤分期、淋巴结转移有关，联合检测两者有助于提高对肺癌的诊断,血浆中甲基化SHOX2、RASSF1A基因阳性率与癌组织、BALF中的结果具有良好的一致性。