福辛普利对去卵巢骨质疏松大鼠的治疗作用和机制研究

裴宝静，李建燕，辛立杰，郭娜，路静，王洋，王庆海*

(1.沧州市中心医院骨二科，河北 沧州 061001；2.河北医科大学基础医学院，河北 石家庄 050017)

骨质疏松症是一种系统性骨代谢疾病，其特征主要表现为骨量逐渐减少，骨微结构损伤及骨折风险增加等[1]。骨重塑通过成骨细胞调节的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收来维持，当骨吸收大于骨形成时，将会导致骨量减少，引起骨质疏松症[2]。肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)的多种生理和病理作用是通过血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)/血管紧张素(angiotensin，Ang)Ⅱ/血管紧张素1型受体(angiotensin type-1 receptor，AT1R)信号和ACE-2/Ang(1-7)/Mas级联介导的[3]。RAS在骨骼健康、结构以及新陈代谢之间具有重要作用，研究表明RAS相关成分(如肾素、ACE-1和AngⅡ受体)对局部骨骼重塑过程具有重要作用[4-5]。此外，几种已知靶向于ACE-2/Ang(1-7)/Mas受体轴介导其作用的药物包括血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)和AT1R阻滞剂，可改善骨密度和骨微结构损伤，对骨质疏松症治疗具有潜在作用[6]。福辛普利是一种ACEI，但对骨质疏松症的研究较少。因此，本研究探讨了福辛普利对卵巢切除术(ovariectomy，OVX)大鼠模型的治疗作用及其对RAS/一氧化氮(nitric oxide，NO)信号通路的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物 60只SPF级SD雌性大鼠(250 ± 5)g购于河北医科大学实验动物中心，大鼠随机分为假手术组、模型组、福辛普利(高剂量组10 mg/kg，中剂量组5 mg/kg，低剂量组2.5 mg/kg)组、阳性对照组(卡托普利40 mg/kg)，每组各10只。所有动物实验均通过动物伦理委员会的同意和批准。

1.2 试剂与仪器 卡托普利片和福辛普利钠片均购买于中美上海施贵宝制药有限公司(上海，中国)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphate，TRACP)试剂盒、骨源性碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)试剂盒、钙测试盒、磷测试盒、NO试剂盒、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(南京，中国)；Anti-AngⅡ抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Dallas，Texas，美国)，AT1R、ACE-1、AT2R抗体均购自Novus Biologicals(Littleton，Colorado，美国)；Micro-CT扫描仪(SkyScan，Kontich，比利时)。

1.3 方法

1.3.1 OVX大鼠模型建立 采用双侧卵巢切除法建立大鼠骨质疏松症模型，造模前大鼠禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，从大鼠背部脊柱两侧分离并切除双侧卵巢；假手术组仅切除卵巢附近的脂肪组织，术后缝合伤口。手术当周为第0周，连续肌肉注射4 d抗生素(氨苄青霉素，4×104U/d)。

1.3.2 给药治疗 根据文献报道给药治疗方法[7]，造模8周后开始灌胃给予福辛普利(10 mg/kg、5 mg/kg和2.5 mg/kg)，阳性对照组灌胃给予卡托普利(40 mg/kg)，模型组和假手术组均灌胃给予等体积生理盐水，每天1次，连续给药6周，每周测量1次体重。

1.3.3 子宫脏器系数 大鼠腹主动脉取血，脱颈椎处死，解剖分离大鼠的子宫并称重，根据公式计算：子宫脏器系数=子宫重量(g)÷体重(100 g)。

1.3.4 骨代谢和骨矿化指标检测 按试剂盒说明书通过标准比色法检测大鼠血清中TRACP、BALP活性以及钙(Ca)和无机磷(P)的水平。

1.3.5 股骨Micro-CT扫描 采用Micro-CT扫描仪分析大鼠股骨近端的骨微结构，分辨率为18 μm。扫描系统于350 ms内以70 kV、85l A和1 000个/180°投影校准。从横截面图像中采用CT Analyzer V 1.11.0.0软件(SkyScan)提取仅包含松质骨的目标体积(volume of interest，VOI)，以进行形态分析。VOI从生长板的下端开始1 mm，向远侧延伸110个横截面(高2 mm)。对于形态分析，通过3D分析(上述CT分析仪软件)在松质骨的每个VOI上计算的骨微结构参数，包括骨密度(bone mineral content，BMD)、骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecular separation/spacing，Tb.Sp)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨表面积组织体积比(bone surface/total volume，BS/TV)。

1.3.6 血清NO和NOS检测 按试剂盒说明书通过标准比色法检测大鼠血清中NO和NOS的含量。

1.3.7 蛋白免疫印迹(Western Blot)法 大鼠脱颈椎处死，分离收集实验大鼠的股骨组织，称取约30 mg，采用Western Blot检测大鼠股骨组织中AngⅡ、AT1R、ACE-1、AT2R的蛋白表达水平。根据制造商说明操作提取组织总蛋白，采用二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)法对蛋白进行定量，加入Loading buffer(4×)100 ℃煮沸5 min，然后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来达到分离蛋白的目的，电泳条件：80 V，30 min；120 V，60 min。采用100 V，90 min将电泳分离后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，用5%脱脂奶粉封闭60 min，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐吐温缓冲液(tris-buffered saline with tween，TBST)洗涤5次，5 min/次，用一抗(AngⅡ、AT1R、ACE-1、AT2R及β-Actin，按1︰1 000稀释)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤5次，5 min/次，用二抗[辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记山羊抗兔IG，按1︰10 000稀释]孵育90 min，TBST洗涤5次，5 min/次，用ECL化学发光法显影检测，Image J分析灰度值，β-Actin用作内参对照。

2 结 果

2.1 福辛普利对OVX大鼠体重和子宫脏器系数的影响 体重结果表明：与假手术组相比，造模后第3周模型组大鼠的体重显著增加，持续至实验结束；从第8周开始给药，与模型组相比，灌胃给予福辛普利能够显著减小OVX大鼠的体重，并呈时间和剂量依赖性(见图1a和表1)。

表1 大鼠体重变化结果

子宫的脏器系数：假手术组(4.92±0.54)mg/g，模型组(1.11±0.15)mg/g，低剂量组(2.11±0.13)mg/g，中剂量组(3.15±0.50)mg/g，高剂量组(3.85±0.49)mg/g，阳性对照组(3.70±0.42)mg/g。子宫的脏器系数结果表明与假手术组相比，模型组大鼠子宫的脏器系数显著减小(P<0.05)；与模型组相比，灌胃给予福辛普利呈剂量依赖性增加OVX大鼠子宫的脏器系数(P<0.05，见图1b)。上述结果表明本研究初步建立了OVX大鼠骨质疏松症模型，并初步表明福辛普利具有潜在的抗骨质疏松症作用。

2.2 福辛普利对OVX大鼠血液中骨代谢和骨矿化的影响 骨代谢检测结果表明与假手术组相比，模型组大鼠血清中TRACP和BALP活性显著增加，灌胃给予福辛普利呈剂量依赖性显著减小OVX大鼠血清中TRACP和BALP活性(见图2a～b)。骨矿化检测结果表明与假手术组相比，模型组大鼠血清中钙和磷水平显著降低，灌胃给予福辛普利呈剂量依赖性显著增加OVX大鼠血清中钙和磷含量(见图2c～d)。上述结果表明福辛普利对OVX大鼠的骨代谢和骨矿化过程具有一定的调节作用(见表2)。

a 大鼠的体重变化情况 b 大鼠子宫的脏器系数

表2 福辛普利对OVX大鼠血液中骨代谢和骨矿化的影响

a 大鼠血清中TRACP活性 b 大鼠血清中BALP活性 c 大鼠血钙水平 d 大鼠血磷水平

2.3 福辛普利对OVX大鼠股骨近端骨微结构和骨密度的影响 采用Micro-CT分析OVX大鼠股骨近端的骨微结构，并对BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N和BS/TV定量分析。股骨骨微结构图像表明OVX大鼠在股骨干骺端的所有骨小梁骨微结构参数中均表现出显著变化(见图3a)。与假手术组相比，OVX组的骨皮质厚度和骨量减少，小梁骨微结构明显受损。相反，灌胃给予福辛普利可显著改善骨微结构损伤，并恢复骨皮质厚度和骨量。与模型组相比，福辛普利治疗组大鼠的BV/TV、BS/TV、Tb.N、Tb.Th以及BMD显著增加(见图3b～g)，这些结果表明福辛普利能够改善OVX大鼠骨小梁的骨微结构参数变化和骨微结构受损(见表3)。

a 大鼠股骨近端的Micro-CT分析图像

表3 大鼠股骨近端骨微结构参数和骨密度值

2.4 福辛普利对OVX大鼠血清中NO和NOS的影响 血清NO和NOS结果表明与假手术组相比，模型组大鼠血清中NO和NOS的含量显著降低；与模型组相比，灌胃给予福辛普利呈剂量依赖性增加OVX大鼠血清中NO和NOS水平(见图4，表4)，上述结果表明福辛普利对OVX大鼠血清中NO信号具有调节作用。

表4 大鼠血液中NO和NOS含量

a 大鼠血清中NO水平 b 大鼠血清中NOS水平

2.5 福辛普利对OVX大鼠股骨组织中局部性RAS系统相关分子表达的影响 Western blot结果表明与假手术组相比，模型组大鼠股骨组织中AngⅡ、AT1R和ACE-1的蛋白表达水平显著上调，同时AT2R的蛋白表达水平下调；灌胃给予福辛普利能够显著下调OVX大鼠股骨组织中AngⅡ、AT1R和ACE-1的蛋白表达水平，并上调AT2R的蛋白表达水平(见图5，表5)，这些结果表明福辛普利对股骨组织中局部性RAS系统具有一定的调节作用。

表5 大鼠股骨组织中局部性RAS系统相关分子表达量

注：与假手术组相比，*P<0.05；与模型组相比，**P<0.05

3 讨 论

RAS是一种内分泌系统，主要介导体液和电解质平衡以及血压方面的功能[7]。但越来越多的研究表明RAS在骨骼系统中具有局部作用[4-6]。本研究发现福辛普利作为一种ACE抑制剂可显著缓解雌激素缺乏大鼠引起的骨质疏松症并改善骨微结构损伤，对骨质疏松症具有潜在的治疗价值。

目前，有许多诱发骨质减少和骨质疏松症的实验动物模型，但OVX大鼠模型是研究骨质疏松症的常见动物模型[8]。OVX大鼠的骨质流失与人(尤其是更年期)的骨骼变化相似，因此FDA推荐OVX大鼠作为评价骨质疏松症潜在治疗药物的模型[9]。雌激素缺乏可引起OVX大鼠的体重增加和子宫萎缩，雌激素是负责性器官如子宫发育的主要雌性激素，并且雌激素通过激活雌激素受体α(estrogen receptor α，ER-α)调节食物需求[10-11]。本研究结果表明与假手术组相比，模型组大鼠的体重从术后3周开始显著增加，并持续至实验结束，同时子宫脏器系数显著减小，上述结果表明本研究初步建立OVX大鼠骨质疏松症模型，为后续药物干预研究奠定了基础。更重要的是，本研究实验结果表明灌胃给予福辛普利能够显著缓解OVX大鼠的体重增加，并增加子宫脏器系数，这表明福辛普利可能对OVX大鼠骨质疏松症具有潜在的治疗价值。

骨代谢生物标志物是骨代谢的有用指标，是监测骨代谢疾病预后和治疗效率的有效工具。BALP由成骨细胞产生，有助于骨骼形成，在骨骼重塑过程中都很重要，研究表明BALP代谢水平在骨质流失过程中会增加[12]。TRACP是破骨细胞皱纹边缘区域发现的一种骨吸收酶，其代谢水平在骨质流失过程中也会显著增加[13]。本研究结果表明OVX大鼠血清中BALP和TRACP活性显著增加，这与之前文献描述是一致的，并且本研究结果也表明灌胃给予福辛普利能够显著降低OVX大鼠血清中BALP和TRACP的活性。另外，沉积于骨骼基质的矿物质占正常骨骼结构的50%～70%，骨矿化过程需要骨骼系统与循环系统以及肾脏之间共同实现，并受到大量抑制或促进相关因素的调控[14]。研究表明包括骨质疏松症在内的骨代谢疾病中的矿物质浓度发生了变化，主要是Ca和P的肾脏清除率升高，导致血清浓度下降，最终引起Ca和P骨沉积受到抑制[15]。本研究表明灌胃给予福辛普利能够增加OVX大鼠血清Ca和P含量。除此之外，骨密度测量和骨微结构分析是骨质疏松症诊断的黄金标准。本研究探究了股骨远端的微环境变化，福辛普利治疗OVX大鼠可明显改善骨微结构损伤，这些研究结果表明福辛普利可能通过影响骨代谢和骨矿化过程对骨质疏松症产生潜在治疗作用。

另外，NO是细胞间与细胞内的一种气体信号分子，NO主要由NOS催化L-精氨酸产生。研究表明NO和NOS在骨代谢过程中有着重要的作用，基础浓度的NO对于破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的增殖及基质分泌是至关重要的[16]。有研究表明OVX大鼠血清中NO和NOS含量显著降低，能够促进骨吸收并抑制骨形成，最终导致骨质流失并引起骨质疏松[17]。本研究结果表明福辛普利能够显著增加OVX大鼠血清中NO和NOS含量。

骨骼局部环境中RAS相关的信号肽、酶和受体均有表达，这表明RAS在骨重塑过程中起着至关重要的作用[18]。本研究中，OVX大鼠股骨组织中经典的ACE-1/AngⅡ/AT1R通路的表达显著上调，而AT2R表达显著下调。福辛普利作为ACE抑制剂能显著下调OVX大鼠股骨组织中ACE-1/AngⅡ/AT1R通路的表达，并且上调AT2R表达。AT2R上调能够增加骨量，对骨流式相关疾病有潜在治疗价值[5]。据报道，ACEI抑制RAS经典的ACE-1/AngⅡ/AT1R信号传导可改善骨骼结构，并且临床研究表明可使ACEI治疗患者的BMD增加，骨折风险降低[19]。

综上所述，本研究结果表明福辛普利能够改善OVX大鼠的体重增加和子宫萎缩，并改善骨代谢、骨矿化过程以及骨微结构损伤。更重要的是，福辛普利能够调节RAS/NO信号对骨质疏松症具有潜在的治疗价值。但福辛普利是否直接作用于RAS/NO信号，或还存在其他信号通路需要后续研究进一步探究。