葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠中TRAIL-R基因敲除对Th17细胞凋亡的影响

2020-12-28金颖莉夏宣平曹曙光林道泼胡定元夏盛隆蒋益

温州医科大学学报 2020年12期

金颖莉，夏宣平，曹曙光，林道泼，胡定元，夏盛隆，蒋益

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院消化内科，浙江温州 325027）

肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL）属于TNF超家族成员之一，与功能性受体结合后，可激活天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）级联反应，产生凋亡信号，选择性诱导异常转化的细胞发生凋亡，而对正常细胞无影响[1-3]。在人体中，TRAIL功能性受体包括TRAIL-R1和TRAIL-R2，又称死亡受体（death receptor，DR）4和DR5，而小鼠体内仅有一种TRAIL功能性受体，即TRAIL-R，与人类DR5高度同源[4]。TRAIL-R广泛表达于各种免疫细胞上，通过调控这些免疫细胞的增殖、活化及凋亡，在维持免疫稳态中发挥重要作用[5-8]。炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一类慢性非特异性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。IBD的病因尚不明确，但免疫因素在IBD发病中起着关键作用[9]。KOBAYASHI等[10]报道，Th17细胞数目和活性与IBD患者肠道炎症程度呈正相关。我们的前期研究表明TRAIL（rs1131568、rs1131579、rs1131580），DR4（rs20575、rs13278062）和DR5（rs1047266）基因多态性与汉族人群IBD的易感性密切相关[11-12]。在此基础上，本研究进一步探讨TRAIL-R基因敲除（TRAIL-R-/-）对小鼠结肠炎及Th17细胞凋亡的影响，为深入揭示TRAIL/TRAIL-R信号通路影响IBD的潜在机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：DSS（相对分子质量36～50 kDa）购自美国MP Biomedicals公司，小鼠外周血淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物公司，RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，PrimeScript反转录酶购自日本TaKaRa公司，iTaqTMUniversal SYBR®Green Supermix购自美国Bio-Rad公司，胎牛血清购自美国Sigma公司，ROR-γt和IL-17A ELISA试剂盒、Caspase酶活性检测试剂盒均购自杭州联科生物公司。兔抗小鼠GAPDH抗体购自北京Affinity公司，兔抗小鼠IL-17A抗体购自英国Abcam公司；大鼠抗小鼠CD4抗体、大鼠抗小鼠CD4-FITC、大鼠抗小鼠IL-17A-PE及Fix & Perm试剂盒购自美国Biolegend公司；山羊抗大鼠Alexa Fluor 594荧光抗体和山羊抗兔Alexa Fluor 647荧光抗体购自美国Jackson公司。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天公司。DAPI染色液购自美国Solarbio公司。

1.1.2 实验动物：C57BL/6品系的TRAIL-R-/-小鼠经CRISPR/Cas9基因敲除技术获得（上海南方模式生物科技发展有限公司）。根据小鼠TRAIL-R基因组序列，设计针对TRAIL-R基因的向导RNA（singleguide RNA，sgRNA），构建sgRNA表达质粒。将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6小鼠受精卵中，获得F0代TRAIL-R+/-小鼠。TRAIL-R+/-小鼠相互杂交后获得TRAIL-R-/-小鼠。采用PCR验证TRAIL-R+/-小鼠和TRAIL-R-/-小鼠的基因型（见图1）。同一品系的WT小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠均在温州医科大学实验动物中心SPF级环境中饲养，动物许可证号：SYXK（浙）2020-0014。

1.2 方法

1.2.1 构建DSS诱导的结肠炎小鼠模型：选择6～8周龄、体质量20～22g的雄性TRAIL-R-/-小鼠和WT小鼠，按照随机数字表法分为TRAIL-R-/-结肠炎组、TRAIL-R-/-对照组、WT结肠炎组和WT对照组，每组9只。根据COOPER等[13]介绍的实验方法构建结肠炎小鼠模型：自由饮用3.5%的DSS溶液连续7 d。对照组小鼠自由饮用清水。造模后每日观察并纪录小鼠的体质量变化、粪便性状和便血情况，计算小鼠的疾病活动指数（disease activity index，DAI）[14]。

图1 PCR验证TRAIL-R基因敲除小鼠基因型

造模第7天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，收集外周血和结肠组织。测量全结肠长度，取部分结肠标本，常规石蜡包埋，连续切片后HE染色，在光学显微镜下采用组织学活动度评分（histology activity index，HAI）[15]对结肠组织进行病理学评估。

1.2.2 提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）和结肠黏膜固有层单个核细胞（lamina propria mononuclear cells，LPMCs）：摘取小鼠眼球取血后置于EDTA抗凝管，采用小鼠外周血淋巴细胞分离液提取PBMCs，置于1.5 mL EP管中备用。结肠组织经清洗、消化和过滤等处理，采用密度梯度离心后，提取溶液中间云雾状层的结肠黏膜LPMCs，置于1.5 mL EP管中备用。

1.2.3 流式细胞术检测Th17细胞的比例：将PBMCs和LPMCs分别重悬于1 mL含10%胎牛血清的RPMI l640培养基中。取200 μL的细胞悬液于96孔板中，加入1%佛波酯/离子霉素混合物2 μL、1%布雷非德菌素A/莫能菌素混合物2 μL后，置于37 ℃、5% CO2培养箱孵育5 h。PBS洗涤，加入抗小鼠FITC-CD4抗体，4℃避光孵育30 min，PBS再次洗涤后加入Fix & Perm，4℃避光孵育15 min后，PBS洗涤，加入抗小鼠IL-17A-PE，4℃避光孵育2 h后，PBS洗涤，上Cytoflex流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司），分析CD4+IL-17A+T细胞占CD4+T细胞比例。

1.2.4 RT-qPCR：分别从PBMCs和LPMCs中提取总RNA，用分光光度计检测RNA的浓度和纯度后，按PrimeScript反转录酶说明书操作，制备cDNA样品。采用iTaqTMUniversal SYBR®Green Supermix进行RT-qPCR检测。引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。小鼠β-actin上游引物：5’-GGCTGTATTCCC CTCCATCG-3’；下游引物：5’-CCAGTTGGTAACGCCATG-3’。小鼠视黄酸相关孤儿受体（retinoic acid-related orphan receptor-γt，ROR-γt）上游引物：5’-CGCAGCC AGCAGTGTAAT-3’；下游引物：5’-TGACAGCATCTCGGGAC AT-3’。小鼠IL-17A上游引物：5’-GATGCTGTTGCTGCT GCTGAG-3’；下游引物：5’-GTGGAACGGTTGAGGTAGTCT GAG-3’。总反应体系10 μL，包括上下游引物各 0.4 μL，SYBR Green 5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.2 μL。反应条件：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40个循环。每个样本3个复孔采用2-△△Ct法分析mRNA的相对表达水平。

1.2.5 Western blot检测：采用蛋白裂解液对结肠组织进行蛋白提取，BCA法检测蛋白浓度，蛋白样品电泳后转膜，5%脱脂奶粉中封闭1.5 h，封闭结束将PVDF膜放入一抗（IL-17A或GAPDH）中，4℃摇床孵育过夜，次日洗涤后在室温下孵育二抗1 h，显影后用Image Lab软件进行分析。

1.2.6 ELISA测定：小鼠外周血离心后取血浆，按产品说明书检测血浆IL-17A浓度。PBMCs和结肠组织分别经匀浆器充分匀浆后经低速离心取上清液，按产品说明书检测ROR-γt浓度。

1.2.7 免疫荧光TUNEL检测：留取小鼠结肠标本，制作5 μm厚度的冰冻切片，4%多聚甲醛溶液中4℃固定10 min后，用0.3% Triton X-100破膜15 min。PBS洗涤后，进行TUNEL染色。PBS洗涤后，用5%的牛血清白蛋白封闭1 h后，加入大鼠抗小鼠CD4抗体，置于湿盒中4 ℃孵育过夜。次日加入山羊抗大鼠Alexa Fluor 594荧光抗体，室温避光孵育60 min后，依次加入兔抗小鼠IL-17A抗体、山羊抗兔Alexa Fluor 647荧光抗体和DAPI染液，最后采用激光共聚焦显微镜分析。

1.2.8 凋亡蛋白酶Caspase的活性检测：整个操作过程在4 ℃环境下完成。取小鼠结肠组织，加入细胞裂解液后，用玻璃匀浆器匀浆后转移到1.5 mL EP管中，裂解10 min后，离心15 min，取上清液。按照试剂盒说明书操作分别检测Caspase 3、Caspase 8 和Caspase 9的酶活性。

1.3 统计学处理方法采用SPSS22.0软件进行统计学分析。首先采用Shapiro-Wilk检验分析原始数据的正态性，结果显示所有数据均呈正态或轻微偏态分布。计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析；采用Tukey’s post-hoc检验对组间比较进行校正，方差齐性者采用LSD-t法，方差不齐者采用Tamhane检验；重复测量资料比较采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1TRAIL-R基因敲除对小鼠结肠炎的影响整个实验过程中，TRAIL-R-/-对照小鼠和WT对照小鼠均未自发性出现腹泻、便血等结肠炎症状，体质量均轻度增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后，TRAIL-R-/-小鼠和WT小鼠都逐渐出现大便次数增多、便血、体质量减轻等。如图2所示，于造模第5天开始，TRAIL-R-/-结肠炎小鼠与WT结肠炎小鼠相比，上述症状更为严重，DAI显著增高（P＜0.01）。造模第7天处死小鼠取结肠组织并测量长度。TRAIL-R-/-结肠炎小鼠与WT结肠炎小鼠相比，其结肠缩短更加明显（P＜0.01），并且HAI评分更高（P＜0.01），表现为结肠黏膜和隐窝结构大量破坏，炎症细胞大量浸润，病变累及深度和范围均显著增加。

2.2TRAIL-R基因敲除对PBMCs和LPMCs中Th17细胞比例及活性的影响如图3-5所示，TRAIL-R-/-对照组小鼠与WT对照组小鼠相比，PBMCs和LPMCs中Th17细胞占CD4+T细胞的比例以及ROR-γt和IL-17A的mRNA以及蛋白表达水平差异均无统计学意义（均P＞0.05）。WT结肠炎小鼠与WT对照组小鼠相比，PBMCs中Th17细胞比例显著增高（P＜0.05），ROR-γt和IL-17A的mRNA和蛋白表达水平亦显著增高（P＜0.05）。TRAIL-R-/-结肠炎小鼠与WT结肠炎小鼠相比，PBMCs中Th17细胞比例显著增高（P＜0.01），ROR-γt和IL-17A的mRNA表达水平亦显著增高（均P＜0.01），并且ROR-γt（P＜0.05）和IL-17A（P＜0.01）的蛋白表达水平也显著增高。进一步在各组小鼠的LPMCs中对上述指标进行检测发现，与WT对照组小鼠相比，WT结肠炎小鼠LPMCs中Th17细胞比例增高（P＜0.05），ROR-γt和IL-17A的mRNA和蛋白表达水平增高（均P＜0.05）。TRAIL-R-/-结肠炎小鼠与WT结肠炎小鼠相比，LPMCs中Th17细胞比例显著增高（P＜0.01），ROR-γt和IL-17A的mRNA和蛋白表达水平显著增高（均P＜0.05）。

图2 TRAIL-R-/-结肠炎小鼠和WT结肠炎小鼠的结肠炎症表现

图3 流式细胞术检测4组小鼠PBMCs和LPMCs中CD4+IL-17A+Th17细胞比例

2.3TRAIL-R基因敲除对结肠组织中Th17细胞凋亡及Caspase酶活性的影响如图6-7所示，免疫荧光检测发现，TRAIL-R-/-对照组小鼠与WT对照组小鼠的结肠组织中CD4+IL-17A+Th17细胞数量极少，因此本研究未对两对照组小鼠结肠组织的Th17细胞做进一步凋亡率统计。TRAIL-R-/-对照小鼠与WT对照小鼠比较，结肠组织中Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的酶活性差异均无统计学意义（均P＞0.05）。WT结肠炎小鼠与WT对照小鼠比较，Caspase 3和Caspase 8的酶活性均显著降低（P＜0.05），而Caspase 9的酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。TRAIL-R-/-结肠炎小鼠结肠组织中Th17细胞的凋亡率（30.51%±2.35%）较WT结肠炎小鼠（72.08%±2.81%）显著降低（P＜0.01），Caspase 3和Caspase 8的酶活性也显著降低（均P＜0.01），而Caspase 9的酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

本研究中TRAIL-R-/-小鼠在清洁级条件下能正常生长、发育和繁殖，这与之前的研究结果[16]基本相符。口服3.5%DSS后，TRAIL-R-/-小鼠较WT小鼠发生了更加严重的结肠炎症反应，这与采用TRAIL-R-/-小鼠构建其他自身免疫性疾病模型的观察结果基本一致[6-7]。本研究在WT结肠炎小鼠与WT小鼠之间比较发现，前者的PBMCs和LPMCs中Th17细胞的比例以及IL-17A和ROR-γt的mRNA和蛋白表达水平都显著高于后者，表明在DSS诱导小鼠发生结肠炎过程中，数目和活性增高的Th17细胞发挥致病作用，这与MA等[17]的研究结论基本一致。再将TRAIL-R-/-结肠炎小鼠与WT结肠炎小鼠进行比较发现，前者的PBMCs和LPMCs中Th17细胞的比例，以及IL-17A和ROR-γt的mRNA和蛋白表达水平都显著高于后者，推测原因可能是：TRAIL-R基因敲除后，TRAIL-R-/-小鼠的PBMCs和LPMCs中活性异常增高的Th17细胞不能被及时清除，促炎性Th17细胞的数目增多，从而导致DSS诱导的TRAIL-R-/-结肠炎小鼠较WT结肠炎小鼠炎症反应更为严重。

图4 4组小鼠外周血（A、B）和结肠黏膜固有层（C、D）中Th17相关转录因子和细胞因子mRNA表达水平的的变化

图5 4组小鼠外周血（A、B）和结肠黏膜固有层（C、D）中Th17相关转录因子和细胞因子蛋白表达水平的变化

越来越多的学者致力于TRAIL/TRAIL-R凋亡信号对免疫细胞的调节功能及相关机制的研究。LI等[18]在类风湿性关节炎小鼠模型中发现腹腔注射DR5受体激动剂TRA-8后，小鼠的关节炎症状得以明显缓解，并且引流淋巴结中Th1和Th17细胞的数目减少，IL-17A水平显著降低。LI等[19]还曾设计表达人/小鼠嵌合型DR5受体的转基因小鼠，该小鼠表达的DR5受体由人DR5的胞外域、小鼠TRAIL-R的跨膜和胞内域共同组成。随后在这种转基因小鼠中构建胶原抗体诱导型关节炎模型，造模成功后采用特异性人DR5受体的激动剂腹腔注射治疗，结果发现小鼠的关节炎症状明显改善，并且在小鼠的关节炎滑膜中还观察到，具有促炎功能的CD11b+Ly-6C+巨噬细胞的数量明显减少。该研究进一步证实此类促炎巨噬细胞数量减少与其凋亡增加相关。IKEDA等[20]在诱导EAE小鼠模型中发现，与WT小鼠相比，TRAIL-/-小鼠会更早出现EAE症状，且病情更加严重，其机制可能与TRAIL-/-小鼠中Th1细胞的凋亡减少有关。PARK等[21]在胶原诱导的关节炎小鼠模型中发现，外源性补充TRAIL治疗能上调小鼠炎性关节组织的Caspase 3，诱导Th17细胞凋亡，进而缓解关节炎症。本研究对结肠组织中Th17细胞的凋亡率及Caspase的酶活性进行比较发现，相比于WT对照小鼠，WT结肠炎小鼠结肠组织中Caspase 3和Caspase 8的酶活性水平显著降低，这与SETIA等[22]在DSS诱导的结肠炎小鼠中的观察结果基本相符；继续在TRAIL-R-/-结肠炎小鼠和WT结肠炎小鼠之间比较发现，前者的结肠组织中Th17细胞凋亡率显著降低，Caspase 3和Caspase 8 的酶活性水平亦显著降低，而Caspase 9的酶活性水平在2组间差异无统计意义差异。理论上，TRAIL与TRAIL-R结合后首先启动细胞外凋亡途径，募集Fas 相关死亡域蛋白，在细胞膜上形成死亡诱导信号复合物，激活Caspase 8，进而启动Caspase级联反应，最终以Caspase 3为凋亡执行蛋白，诱导细胞凋亡。而当细胞受到DNA损伤、氧化等因素刺激时，将激活线粒体参与的细胞内凋亡途径，激活Caspase 9，最后亦通过Caspase 3诱导靶细胞凋亡。因此，本研究推测TRAIL-R基因敲除可能抑制Caspase 8和 Caspase 3介导的细胞外凋亡途径，而不影响Caspase 9参与的细胞内凋亡途径，造成炎性肠黏膜组织中具有促炎活性的Th17细胞凋亡减少，Th17细胞的数目和活性增高，从而导致DSS诱导的TRAIL-R-/-结肠炎小鼠较WT结肠炎小鼠更为严重。