糖皮质激素受体对大鼠丙泊酚依赖行为的影响及其机制

董张雷，梁宇渊，苏颖，林函，王本福

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 麻醉与围术期医学科，浙江 温州 325027）

丙泊酚是一种短效静脉麻醉药，因使用方便，诱导平稳，苏醒迅速等优点，被广泛用于麻醉及ICU镇静。临床资料和动物实验均表明丙泊酚存在潜在的精神依赖和滥用倾向[1-4]。伏隔核（nucleus accumbens，NAc）多巴胺系统是中脑边缘系统重要组成部分，参与众多药物成瘾过程。前期研究表明，NAc多巴胺D1受体参与丙泊酚自身给药行为[4]。糖皮质激素（glucocorticoid，GC）由HPA轴分泌，通过调节NAc内多巴胺释放及多巴胺受体表达来影响药物成瘾[5]。本实验通过颈内静脉自身给药方法建立大鼠丙泊酚依赖模型，腹腔注射糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）拮抗剂RU486，观察大鼠丙泊酚依赖行为改变，并检测NAc内多巴胺转运体（dopamine transporter，DAT）蛋白的表达，探讨GR对大鼠丙泊酚觅药行为的影响，以及丙泊酚精神依赖性的发生机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级雄性SD大鼠48只（上海斯莱克实验动物中心），14周龄，体质量250～280 g。动物分笼饲养于通风良好的动物房内，24 h昼夜节律（9 am—9 pm），每日限制进食30 g，自由进水。环境温度22～24℃，相对湿度50%～70%。

1.1.2 试剂及配置：RU486（美国Sigma公司）为脂溶性药物，易穿过血-脑屏障，由10%无水乙醇溶解备用，可通过外周给药。丙泊酚（意大利阿斯利康公司，批号NK317），Anti-Dopamine Transporter antibody（英国Abcam公司），大鼠自发反应操作笼（宁波生物科技研究所），电子天平（德国赛多利斯公司），电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠静脉给药训练：24只大鼠颈内静脉置管后进行丙泊酚自身给药行为训练，方法同文献[4]。每天9:00—12:00为训练时间，每天训练3 h，连续训练14 d，直到大鼠自身给药行为稳定。实验前确定大鼠颈内静脉血管通畅、无渗漏，实验期内禁食。大鼠自身给药训练选用FR1强化程序，整个实验过程由计算机自动控制并记录。第15天在训练开始前1 h将大鼠随机分成4组（每组6只），分别腹腔注射0.9%氯化钠溶液或RU486 10、20和40 mg/kg，观察对大鼠自身觅药行为的影响。

1.2.2 Western blot检测：第15天大鼠训练结束后立即将大鼠处死，将分离出的脑组织放入匀浆器中，加入蛋白酶抑制剂和裂解液，充分捣碎后静置数分钟。然后将脑组织匀浆液转移至1.5 mL离心管内，超声破碎，离心机离心后用EXCEL制作蛋白浓度测定盒描绘标准曲线测定样品蛋白浓度。在蛋白上清液中加入Loading buffer，煮沸使其变性，于-20℃冰箱保存。10%分离胶和5%浓缩胶制胶，20 μL总蛋白上样。电泳转膜后室温封闭2 h。加一抗，4 ℃摇床过夜，二抗常温孵育2 h，加抗体前均需TBST洗3次。用ECL试剂盒暗室曝光，显影、定影，Image J 2.0软件分析结果。

1.2.3 自身给予蔗糖实验：取剩余24只大鼠放入训练笼，在训练笼上端的容器内放入100颗蔗糖颗粒，开启FR1自身训练程序，训练时间为30 min，连续训练7 d。训练过程同丙泊酚自身给药模型，唯一区别是触碰有效鼻触时获得的是蔗糖颗粒。在第8天训练开始前1 h将大鼠随机分为4组（每组6只），分别注射0.9%氯化钠溶液或RU486 10、20和40 mg/kg，记录RU486对大鼠自身给予蔗糖行为的影响。计算机自动记录实验过程。

1.3 统计学处理方法 用SPSS26.0统计软件进行分析。所有数据均服从正态分布，以±s表示，其中模型建立数据采用重复测量方差分析，腹腔注射给药后各组大鼠行为学对比及Western blot检测结果采用单因素方差分析，Levene法检验方差齐性，两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腹腔注射RU486对大鼠丙泊酚自身觅药行为的影响 随着丙泊酚静脉自身给药行为训练天数的增加，大鼠有效鼻触次数和药物泵注次数逐渐增加并趋于稳定，而无效鼻触次数一直处于较低水平。和无效鼻触次数比，有效鼻触次数明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01），说明大鼠丙泊酚自身给药行为稳定（见图1）。第15天训练前1 h，4组大鼠分别腹腔注射0.9%氯化钠溶液和10、20、40 mg/kg RU486。与对照组比，各RU486组大鼠有效鼻触次数和有效泵注次数呈剂量依赖性下降（P＜0.01），无效鼻触次数则无明显变化（P＞0.05），见图2。

图1 大鼠丙泊酚自身给药模型建立（n=24）

图2 腹腔注射RU486对大鼠丙泊酚自身觅药行为的影响（每组n=6）

2.2 腹腔注射RU486对NAc内DAT蛋白表达的影响 与对照组比，腹腔注射RU486（10、20、40 mg/kg）后，NAc内DAT蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），见图3。

图3 腹腔注射RU486对丙泊酚依赖大鼠NAc内DAT蛋白表达的影响（每组n=6）

2.3 腹腔注射RU486对大鼠自身给予蔗糖行为的影响 大鼠自身给予蔗糖训练第5天起，蔗糖颗粒摄入次数保持在100次水平，表明模型稳定。第8天4组大鼠分别腹腔注射0.9%氯化钠溶液和10、20、40 mg/kg RU486，与对照组比，RU486不同剂量组有效鼻触次数、无效鼻触次数及摄入蔗糖颗粒数均无明显变化（P＞0.05），见图4。

图4 腹腔注射RU486对大鼠自身给予蔗糖行为的影响（每组n=6）

3 讨论

关于丙泊酚滥用和死亡的报道越来越多，但具体的成瘾机制仍未完全阐明[6]。GC是HPA轴激活后肾上腺皮质分泌的激素，对中枢神经系统有较强的作用，参与认知功能、情绪变化的调控及成瘾状态的调节[7]。研究显示，GC过度分泌可易化个体药物滥用倾向[8]，GC参与药物的奖赏作用，如肾上腺切除的动物对精神类药物的摄入明显减少，且NAc多巴胺浓度明显降低[9]，而GR激动剂增加动物对大多数成瘾药物（如吗啡、可卡因等）的精神依赖性[10]，使用Cre-loxP基因重组方法敲除神经系统GR或使用GR拮抗剂均可减弱动物对可卡因的依赖性[11]。本实验发现，腹腔注射GR拮抗剂RU486能剂量依赖性地减少大鼠丙泊酚觅药行为，而不影响蔗糖自身给药行为，表明GR参与丙泊酚精神依赖性且具有特异性。

GC集中分布于NAc、海马、杏仁核、皮质层等各个脑区，主要调节多巴胺受体的表达。而药物的奖赏效应主要与多巴胺系统有关，尤其是中脑腹侧被盖区（VTA）至NAc的多巴胺能神经通路[12]。增加NAc细胞外的多巴胺含量可产生奖赏效应，反之则减弱奖赏效应。DAT属于Na/Cl依赖转运体家族的一员，是多巴胺神经元前膜的一种膜蛋白，限制多巴胺能受体激活的持续时间、程度和范围，终止神经细胞间的信息传递，尤其是对突触间隙间的多巴胺的重摄取，维持神经元内多巴胺浓度的稳态[13-14]，因此，DAT功能失调会导致脑内多巴胺水平失衡，引起精神分裂及药物依赖等多种精神疾病。目前普遍认为精神兴奋性药物主要通过作用于DAT来调节多巴胺能神经信号通路，提高突触间隙间多巴胺含量，促进其在中脑边缘皮质奖赏通路中发挥作用从而诱发奖赏行为或精神依赖[15]。大量研究证实DAT表达水平与可卡因、安非他命等药物成瘾关系密切。安非他命通过囊泡释放和促进DAT逆向转运引起细胞外多巴胺浓度升高[16]。DAT敲除的小鼠对可卡因的成瘾行为消失，同时DAT阻滞剂JHW007明显降低可卡因成瘾动机和其引起的NAc细胞外多巴胺的增加[17-18]。可卡因急性给药可引起多巴胺能神经元细胞外多巴胺浓度升高[19]，PAIN等[20]也发现麻醉或亚麻醉剂量的丙泊酚增加NAc细胞外的多巴胺水平。而我们前期研究也发现多巴胺D1受体参与介导丙泊酚成瘾行为[4]，因此我们推测DAT蛋白在丙泊酚成瘾行为中也可能发挥作用。本研究结果发现，腹腔注射RU486能降低大鼠NAc内的DAT蛋白水平并减少大鼠觅药行为，提示RU486可能通过减少NAc内DAT的蛋白水平，导致神经元细胞外多巴胺浓度减少，从而降低了大鼠的觅药动机。

综上所述，本实验显示，GR参与介导丙泊酚的自身给药行为，GR拮抗剂RU486可能通过降低NAc内DAT水平而减弱大鼠丙泊酚觅药行为。