富血小板血浆在组织工程研究中的应用现状

段江涛，朱伦井，彭称飞，王宁，陈俊毅，贝朝涌

（桂林医学院附属医院四肢创伤骨科，广西 桂林）

0 引言

富血小板血浆（PRP）是血液浓缩产物，含有大量血小板，可通过离心或血液分离技术得到。

全血离心后，可以明显区分红细胞层和血浆层。在中间可以找到含有大部分白细胞和血小板的血沉棕黄层，再将其用于制备PRP。在某些方案中，对血沉棕黄层/血浆层再次离心可获得更纯化浓缩的PRP[1]。

传统上将PRP定义为含浓度至少200-1，000×103/μL血小板的血浆[2]。根据PRP的激活方法分为内源性和外源性激活[3]。多使用凝血酶和/或氯化钙激活PRP[4]，激活后形成水凝胶，其可持续分泌生长因子[5]，并可运载细胞[5-6]。

血小板可释放转化生长因子β（TGF-β），成纤维细胞生长因子2，血小板衍生生长因子的亚型（PDGF-AA，PDGF-AB，PDGFBB），胰岛素样生长因子-1，表皮生长因子和肝细胞生长因子[7]。Jalowiec等[5]的研究表明，凝血酶活化形成的血小板凝胶中血小板浓度与蛋白质的分泌之间呈正相关，并且在凝胶化后最初的4小时内观察到生长因子释放峰值。在不同血小板浓度下均发现TGF-β1的高水平释放，其次是PDGF-AB和PDGF-BB。此外，他们发现PRP凝胶还释放了炎症介质，释放最多的是趋化因子CCL5。与此对应，El-Sharkawy等[8]报道了PRP中生长因子的高水平。此外，他们还发现了脂质介体脂蛋白A4含量增加，已知其与炎症消除有关。因此，PRP可释放细胞因子并可抑制炎症反应。

PRP存在生物学差异，不同的制备方法会加剧这种差异[9]。kushida等[10]报道了七种商业制备系统制备的活化PRP中生长因子浓度的巨大差异。Mazzocca等[11]从8位健康受试者身上抽取血液，除了一步离心法和两步离心法在血小板浓度方面的差异外，他们还强调了不管如何选取分离方法，血小板计数和生长因子浓度存在着显著个体差异。

尽管PRP暂时达不到统一的标准化制备，其已被广泛地应用于临床。PRP的应用旨在基于其含有的丰富生长因子，通过各种未尽知的机制来促进组织再生。Hsu等[12]回顾了骨水泥中加入PRP在肌肉骨骼再生中的应用，并指出了多种因素对治疗成功与否的影响。

根据白细胞含量多寡可以分为贫白细胞和富白细胞PRP。应根据应用部位来选择PRP中白细胞的浓度。例如，贫白细胞PRP适用于关节腔内注射[13,14]。除骨科和运动医学外，医学其他领域也已有PRP的多种治疗应用。

1 组织工程中的PRP

骨、软骨、皮肤和软组织修复，各种组织工程研究中均有PRP的应用。除将PRP当作生长因子来源外，更多的作为生长因子和/或细胞的递送体与生物材料相结合来构建工程复合体。在这些研究中，PRP的制备以及使用方法多样，特别是血小板的浓度、是否进行活化以及活化方法的选择。比较各研究中PRP功效的主要障碍是：（1）所有血小板产品都存在较大的供体变异，（2）血小板的浓度、是否进行活化以及活化方法的选择没有统一标准。有研究系统地验证了不同血小板浓度对生长因子释放和掺入PRP凝胶中的细胞的影响，也突显了这一障碍[5]。这项研究结果表明，释放的生长因子的浓度与血小板浓度密切相关，并且对MSC的活力和增殖有影响，对比分析后发现最有利的血小板浓度为1，000×103/μL（3.3到6.7倍）[5]。

2 复合支架应用于骨缺损修复

PRP最多用于骨组织工程领域，已作为细胞载体和/或成骨和成血管的生长因子来源。2005年Hokugo等人[15]报道PRP与可降解的生物材料冻干水基明胶结合具有促进体内骨修复的作用。在这项研究中，研究者将平均血小板浓度为1，200×103/μL（6倍）的兔PRP包被在冻干水基明胶上，结果表明，向明胶中添加PRP会导致血小板活化释放生长因子，类似于凝血 酶活化。在兔尺骨缺损模型中测试了这种复合材料的成骨诱导特性，并与单独使用明胶、单独应用PRP或PRP结合纤维蛋白进行了比较，其中PRP复合明胶组新生骨形成最明显。他们假设这种增强成骨的作用来源于冻干水基明胶可捕获PRP释放的生长因子，从而在水凝胶降解时持续释放多种生长因子[15]。还有其他研究将PRP与各种陶瓷材料结合在一起。El Backly等[16]将PRP与羟基磷灰石-β-磷酸三钙支架（SkeliteTM）结合使用，并在临界大小的兔颅骨缺损中进行了测试。在支架上添加浓度为3，000×103/μL的冻干人PRP后，使用凝血酶和葡萄糖酸钙激活。结果表明，激活PRP可提高颅骨缺损内的细胞及类骨质沉积，这归因于PRP的化学吸引作用[16]。

骨组织工程还将PRP与细胞结合使用，其中PRP既可作为细胞载体，又可作为自体生长因子的供体来源。在Kretlow等人的研究中[17]将未培养的骨髓单个核细胞放于珊瑚羟基磷灰石支架或聚（L-乳酸）支架中，一组复合（8.6±3.2倍）PRP，一组不复合进行研究。在临界大小的大鼠颅骨缺损模型中，骨髓单个核细胞对成骨具有促进作用，而复合PRP并不能增强成骨作用。与之相反，在纳米硫酸钙支架和BMP-2修饰的MSC中添加PRP（未指定血小板浓度）可促进成骨[18]。

除了促进成骨分化外，PRP还被用作MSC和内皮祖细胞的载体，以促进骨组织工程复合体中血管的形成[19]。这项研究证明了PRP（浓度2，000×103/μL）可作为内皮祖细胞的载体，皮下移植即可在植入物内促进新血管形成[17]。原因可能是PRP释放的生长因子中血管生长因子的含量高[5]。Zahn等人最近的一项研究证明了PRP作为促血管生成细胞递送载体的功能。[6]PRP凝胶（血小板浓度2，000×103/μL）能够包裹人脐静脉内皮细胞和MSC来形成血管样结构。

3 骨软骨及软骨缺损修复

PRP在组织工程中的应用不仅限于骨组织。一些实验已经研究了PRP在骨软骨和软骨修复中的作用。大多数研究都将PRP作为软骨细胞或祖细胞的载体。例如，Xie等人[20]发表了一项对比实验，检测了PRP输送的骨髓MSC和ASC的骨软骨修复再生潜力。虽然单独应用PRP（平均浓度为1，670×103/μL）不具有再生能力，但两种细胞复合PRP均能介导软骨基质的形成[20]。

4 牙科应用

在颅颌面部应用中特别进行了PRP的研究。一份临床报告表明，在植入牙种植体后以PRP凝胶形式将MSC植入窦底以增强其功能，2至6年的随访期内显示出积极的结果[19]。

5 软组织修复

最近的流变学研究中已确定，PRP活化后会形成柔软的水 凝胶[5]。它因此成为软组织修复的最佳材料。PRP已被用于脂肪和皮肤损伤修复，并用作粘合剂来闭合伤口。例如，有研究显示，固定在明胶微球上的PRP（平均富集6.4倍）可促进皮下植入后脂肪的血管形成[21]。据报道，由PRP、贫血小板血浆制备的冷沉淀、凝血酶混合产生的膜样物质可作为生物活性粘合剂，在慢性溃疡小鼠模型中介导伤口修复[22]。

6 总结

综上，PRP已在各种组织工程研究中得到应用，并且结果不禁相同。在这些研究中对PRP的使用包括1.利用PRP作为自体水凝胶细胞载体2.用作促进细胞粘附、血管生成或组织再生的生长因子来源。对于后者，一些研究提示了在更长的时间内维持生长因子释放的重要性，例如，使用明胶或肝素结合的纤维蛋白水凝胶包裹活化PRP来缓释生长因子。不足的是大多数研究并未探究PRP的作用方式。此外，PRP一般会作为材料的一部分用于与细胞和生物材料复合，此类设计无法明确单个成分的作用。这些不足说明了在组织工程研究中PRP的作用特点、作用大小仍然不明确。

作为生长因子的自体递送载体，PRP具有将组织工程学方法发展成为再生疗法的固有部分的潜力。为了在临床环境中PRP应用的安全性和可预测性，将来进行系统且深入的研究至关重要。