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细胞周期蛋白依赖性激酶9及其抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展

2020-12-28王向远郭青龙惠慧

世界最新医学信息文摘 2020年8期
关键词:激酶细胞周期磷酸化

王向远,郭青龙,惠慧

(江苏省南京市鼓楼区童家巷24号中国药科大学玄武门校区,江苏省肿瘤发生与干预重点实验室,江苏 南京)

0 引言

细胞周期的进展受严密调控因子的复杂网络控制,其中关键是细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk / Cdc)[1]。细胞周期控制机制的崩溃是癌症的重要特征之一,而靶向细胞周期调控是癌症治疗中反复出现的主题[2]。与化学疗法相比,靶向疗法具有最大化疗效和降低毒性的优势[3,4]。临床前研究已经确定了几个潜在的靶标,而CDK9是最近引起人们越来越多兴趣的药物靶标之一。抑制CDK9能够选择性地降低许多癌症中上调的蛋白质,从而引起细胞增殖抑制和凋亡[5]。CDK9抑制剂单独使用以及与常规化疗(例如抗代谢物或微管抑制剂)联用的方案都进入了临床研究阶段[6]。

1 CDK9的发展简述

细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)家族由以下成员组成,这些成员是细胞分裂周期的关键调控因子(细胞周期CDK),参与基因转录的调控蛋白(转录CDK)以及具有其他功能的CDK,例如CDK5参与正常的神经元迁移和分化,轴突伸长和突触[7]。细胞分裂周期的正确时机和顺序需要细胞周期CDK 1、2、3、4和6,而转录CDK7和CDK9通过羧基末端结构域(C-terminal domain,CTD)的磷酸化来调节RNA聚合酶II的活性[8]。它在RNA转录和延伸、细胞分化的调控以及其它细胞生物学过程中发挥重要作用。最近研究表明,CDK9 与艾滋病、心肌细胞肥大、血管生成、炎症等疾病的发病过程有关,且CDK9在多种肿瘤的发展过程中起着至关重要的作用[9,10]。

1994年,CDK9首次被发现,因为它具有Pro-Ile-Thr-Ala-Leu-Arg-Glu特征性而被命名为PITALRE[11]。PITALRE被确定为正转录延伸因子b(positive transcription elongation factor b,P-TEFb)的催化亚基,P-TEFb是一种蛋白激酶复合物,可在体外过度磷酸化RNA聚合酶II大亚基的CTD。有人将P-TEFb描述为新的CDK/细胞周期蛋白对,首次将其亚基命名为CDK9和Cyclin T。此后,鉴定出了Cyclin T1、T2a、T2b和K[12]。CDK9与Cyclin T1,T2a,T2b和K形成异源二聚体复合物。Cyclin T2a和T2b是同一个基因的两种mRNA剪接产物,在其C端具有67个氨基酸[13]。CDK9在其所有组织中均普遍表达,其激活剂Cyclin T1、T2a和T2b细胞周期蛋白也如此[14]。而Cyclin K主要在睾丸,胃和骨髓中表达[15,16]。

自CDK9被发现以来,一直被人们认为是分子量约42 kDa的蛋白质。然而2003年,研究人员鉴定出了一种新的同工型,该同工型是从同一基因的替代启动子转录而来,比原始启动子重13 kDa。自此CDK9同工型开始被命名为CDK942和CDK955[17]。研究表明,这两种亚型均存在于HeLa,NIH/3T3人类巨噬细胞和小鼠肺和肝组织,但丰度不同。相关研究结果表明CDK942和CDK955同工型的表达受到差异调节,并且这两种同工型之间的功能差异可能取决于其亚细胞定位、表达模式以及对底物获取方式的不同。且CDK942和CDK955启动子具有不同的活性和对激活信号的响应[18]。相关研究发现,CDK942在RNA转录和延伸、细胞分化调控等细胞生物学过程中发挥重要作用。而CDK955能与参与DNA修复的蛋白质Ku70特异性结合,但CDK942与这种作用不相关,表明CDK955可能在DNA的修复中起作用[19]。这些结果表明,尽管尚未在文献中对其进行具体表征,但应区分这两种同工型的功能。

2 CDK9的作用机制

CDK9不是典型的Cdc2样激酶,不参与细胞周期调控过程。相反,它在转录过程中起作用。CDK9是转录CDKs亚家族的重要成员,该家族是一组激酶,其功能是控制真核RNA聚合酶II合成和加工mRNA的主要步骤[20]。作为细胞周期蛋白依赖性激酶,体内CDK9激活取决于其与Cyclin T的结合,以组装P-TEFb。虽然有其他能够使CTD磷酸化的细胞周期蛋白依赖性激酶,但是唯一以催化剂方式激活基因表达的激酶是CDK9。因此,Cyclin T /CDK9是一种在转录中起作用的专用激酶,而在体内CTD是该复合物的主要功能靶点[21]。尽管CDK9的基本机制很复杂并且尚未完全阐明。

RNA聚合酶II负责真核生物中蛋白质编码基因的转录,与所有其他RNA聚合酶的不同之处在于,其最大的亚基包含一个CTD,该域由七肽重复序列和YSPTSPS共有序列组成[22,23]。CTD的磷酸化与转录循环中的各个步骤相关。次磷酸化的RNA聚合酶II被募集到转录起始位点,并形成预起始复合物。

CTD的磷酸化位点数量超过50个,丝氨酸是其主要的磷酸化位点[24]。而由CDKs对CTD进行磷酸化的主要有2种:一种是CDK7磷酸化的Ser5(YSPTSer5PS)[25,26],另一种是CDK9磷酸化的Ser2(YSer2PTSPS)[27]。首先,CDK7磷酸化Ser5,从而激活RNA聚合酶II,Ser5磷酸化的RNA聚合酶II能够刺激RNA的转录,但不是其延伸过程[28,29]。P-TEFb对Ser2的磷酸化作用促使RNA转录的延伸。因此,P-TEFb对在细胞中产生成熟的mRNA是必不可少的。

CDK9的活性取决于与Cyclin T的结合,并通过与其他大分子的结合而进一步受到调节。这些调节剂包括激活剂,例如c-myc,NF-κB,雄激素受体,Brd4 或超伸长复合物的亚基和抑制蛋白复合物,例如含有复合物的抑制性7SK小核RNA(7SK snRNA)[30-33]。CDK9的激酶活性失调与多种人类病理状况有关,例如过度增生性疾病(例如癌症),以及病毒引起的传染病和心血管疾病。PTEFb介导的短寿命抗凋亡生存蛋白的转录,Mcl-1等癌基因和c-MYC等癌基因在癌细胞的生长和存活中起着至关重要的作用。另外,这些蛋白质在对化学疗法的抗性发展中显示出重要的功能。抑制CDK9会导致这些重要的生存蛋白和癌基因的短寿mRNA转录本迅速耗尽。因此,选择性暂时抑制排他性转录调节CDK9是癌症治疗中一种有希望的新方法[7]。

3 CDK9抑制剂的研究进展

对小分子的研究是发现靶向癌症治疗成功药物的基础。CDK9是许多癌症的转录调节因子和潜在治疗靶标。多种非选择性CDK9抑制剂已在临床上取得进展。本文中,我们总结了一些被设计为具有CDK9抑制作用的抗肿瘤药物的小分子以及相关临床研究的进展。

3.1 非选择性CDK9抑制剂

3.1.1 Flavopiridol

Flavopiridol是一类天然黄酮类化合物,它是第1个被发现的CDK9抑制剂,也是最先进入临床研究的CDK9抑制剂。Flavopiridol抑制CDKs,CDKs控制细胞周期进程并磷酸化RNA聚合酶II的CTD[11]。其对CDK9抑制的效力最好,在复发性或难治性慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)患者中有很好的疗效,其抗肿瘤活性似乎是CDK9介导的抗凋亡蛋白转录的下调,目前已经是美国FDA指定用于CLL治疗的孤儿药。然而,Flavopiridol在Ⅰ,Ⅱ期临床试验中出现了很多不良反应,如血小板减少、血栓、嗜中性白血球减少、疲乏等[34,35]。上述严重毒性的高发生率阻碍了其作为疗法的临床发展。

3.1.2 Dinaciclib

Dinaciclib是目前最先进的CDK9抑制剂,是一种有效的选择性CDK抑制剂,抑制CDK2,CDK5,CDK1和CDK9的IC50分别为1,1,3和4nM[36]。目前处于针对CLL作为单一药物的III期临床试验和针对不同血液恶性肿瘤以及某些实体瘤的II期临床试验中[37]。然而,其药代动力学性能差,缺乏对CDK9的长时间抑制作用[38,39]。在三项涉及该药的II期研究中,对治疗没有完全反应,并且75-95%的患者遭受了不良反应[2]。据报道其有几种免疫相关的不良反应,如中性粒细胞减少和白细胞减少。同 flavopiridol一样,它也被赋予了CLL的孤儿药地位。

3.1.3 SNS-032

SNS-032是CDK2,7和9的有效和选择性抑制剂,IC50 值分别为48,62 和4 nM。SNS-032对CDK1和CDK4的敏感性较低,IC50分别为480 nM和925 nM。与Flavopiridol相比,SNS-032在抑制RNA合成和诱导细胞凋亡方面更有效,SNS-032的活性易于逆转。在分子水平上,SNS-032诱导RNA聚合酶II的ser2和ser5去磷酸化,并抑制CDK2和CDK9以及去磷酸化CDK7的表达[40]。无论预后指标和治疗史如何,SNS-032均可在体外有效杀死CLL细胞。研究表明,SNS-032在白血病和实体瘤中具有抗肿瘤活性[41,42]。对转移性难治性实体瘤患者进行的I期临床试验研究表明,SNS-032具有良好的耐受性,对于口服给药可能是可行的[43]。在I期临床试验中,SNS-032在晚期CLL和多发性骨髓瘤患者中表现出适度的临床活动[44]。但是和其他的非选择性CDK9抑制剂一样,SNS-032的不良反应发生率高且较为严重[45]。

3.1.4 Seliciclib

Seliciclib已被证明是多种CDK的有效抑制剂,其对CDK1,CDK2,CDK5,CDK7,CDK9的IC50 值分 别 为0.65μM,0.7μM,0.2μM,0.49μM和0.79μM。Seliciclib对CDK4,CDK6和 其 他80多种其他激酶均不敏感或仅被弱抑制[46]。在肿瘤细胞中,Seliciclib诱导细胞凋亡,同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2家族成员Mcl-1[47,48]。Seliciclib已在许多I期和II期临床试验中进行了测试,该药物已用于治疗约450名癌症患者,并这些患者中显示出约一半的抗癌活性。Seliciclib还已经在I期试验中与吉西他滨和顺铂联用在非小细胞肺癌患者中进行了测试。Seliciclib还正在与晚期核实体瘤患者一起用核苷类似物Sapacitabine(CYC682)联合治疗进行临床测试,并与EGFR抑制剂Erlotininb(Tarceva)联合用于晚期实体瘤标志物[49,50]。

3.2 选择性CDK9抑制剂

3.2.1 AZD4573

AZD4573是一种新型的,高效且高选择性的CDK9抑制剂。其抗肿瘤活性在体外广泛的癌细胞系以及体内细胞系和患者来源的异种移植模型中得到了确定。它被证明在体外血液癌症模型中广泛地快速诱导细胞凋亡和随后的细胞死亡,并且以剂量和时间依赖性的方式消耗Mcl-1,这是AZD4573诱导肿瘤细胞死亡的主要机制。目前正在I期临床试验中对患有血液系统恶性肿瘤的患者进行AZD4573的评估[51]。

3.2.2 atuveciclib

atuveciclib是第一种进入临床试验的有效且高度选择性的PTEFb / CDK9抑制剂。该化合物在体外显示出强大的PTEFb抑制活性和高激酶选择性。 atuveciclib在小鼠和大鼠的急性髓样白血病的人类异种移植肿瘤模型中均有效。该化合物在每日一次给药以及间歇给药方案后均具有活性,为优化人类给药方案的有效性和耐受性提供了宝贵的选择[52]。

3.2.3 CDKI-73

CDKI-73是CDK9的高效小分子抑制剂。它显示出对来自不同来源的多种癌细胞系的有效细胞毒性作用,但已证明对正常细胞的毒性较小。CDKI-73诱导caspase依赖性细胞凋亡,其后是CDK9和RNA聚合酶II ser2位点脱磷酸化。与正常的CD34+细胞相比,CDKI-73比泛CDK抑制剂Flavopiridol更有效,并且对原发性白血病细胞的选择性超过200倍[53]。CDKI-73还通过与多种抗凋亡蛋白(例如Mcl-1,Bcl-2和XIAP)转录抑制相关的机制显示了与氟达拉滨的协同作用,这为治疗CLL和氟达拉滨复发疾病提供了有前景的治疗策略。此外,最近,Lam等人对A2780卵巢癌细胞的敲低研究表明,CDK9的下调通过Mnk-eIF4E轴影响了致癌翻译[54]。

4 结语

CDK9是癌症治疗中不断发展的目标。CDK9抑制剂在体外已显示出良好的抗肿瘤活性。CDK9抑制剂也在临床前模型中显示出了广阔的前景,目前已经有有许多CDK9抑制剂被开发出来,其在单药以及与其他抗癌药联用中临床试验显示出较好的治疗效果。但是由于大多数CDK9抑制剂对其他CDKs和酶缺乏选择性,因而在临床试验中治疗窗口狭窄,并具有严重的并发症以及明显的副作用。因此,可以预想高选择性CDK9抑制剂的研发将为肿瘤提供极具潜力的疗法。

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