血管内皮中KLF2的表观遗传修饰调控#

姚裕锋黄绍刚林泽帆陈奕钿李枞森陈嘉莹曾小耘

（1. 汕头大学医学院临床医学专业本科生，广东 汕头 515041；2.汕头大学医学院化学教研室，广东 汕头515041）

血管内皮细胞（Vascular endothelial cell，VEC）是各种生理刺激的重要整合者和转化者，参与众多生理过程[1]。各种刺激可调节VEC表型，如层流诱发内皮一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和血栓调节蛋白（Thrombomodulin，TM）表达，使VEC有效抗血栓、抗黏附和抗炎[2]。相反，许多有害刺激如湍流、促炎细胞因子或晚期糖基化终产物[3]可能使VEC功能失调，最终降低eNOS表达，促进血管细胞粘附分子-1（Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）转录，并表达VEC促凝表型[1]。Krüppel样转录因子2（Krüppel-like factor 2，KLF2）作为Krüppel样转录因子家族中的重要成员，参与VEC中多种基因的转录调节，从而发挥VEC抗血栓、抗炎和抗氧化等生理作用。对KLF2的研究，可为临床上心血管药物的开发提供重要的思路。现对KLF2的表观遗传修饰的调控机制予以综述。

1 KLF2调控的结构基础

KLF2可调节VEC中多种基因的转录活性，同时其转录活性也接受多个因子的调节。位点分析表明在KLF2保守的启动子区域内存在肌细胞增强因子2（Myocyte enhancer factor 2，MEF2）的结合位点，后者为KLF2关键的正性转录因子[4]。IIa类组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDACs）包括HDAC4/5/6/7/9/10，为MEF2转录活性的负性调节因子。表观遗传学中，组蛋白乙酰转移酶可诱导KLF2组蛋白中赖氨酸的乙酰化，使核小体松弛，增强转录活性，而HDACs则可对抗这种过程[5]。IIa类HDACs N端结构域高度保守，可介导其与MEF2的结合，使MEF2去乙酰化，抑制MEF2的转录活性，在转录水平调节KLF2的表达[6,7]。IIa类HDACs N端丝氨酸残基的磷酸化状态是决定其细胞定位和与MEF2相互作用的关键因素，其磷酸化将导致MEF2的解离和核输出，从而促进KLF2表达[5]。HDAC5还可直接与KLF2蛋白结合，降低其对靶基因的转录活性[8]。KLF2 mRNA的3’端非编码区可与microRNA-92a（miR-92a）结合，后者促进KLF2 mRNA降解和抑制KLF2蛋白翻译，在转录后水平调节KLF2的表达[9]。KLF2蛋白氨基端由转录激活和转录抑制结构域构成，其中转录抑制区能与含WW结构域的E3泛素连接酶（WW domain E3 ubiquitin ligase 1，WWP1）结合，介导KLF2的泛素化和蛋白酶降解途径[10]；羧基端包含三个串联的Cys2/His2锌指结构序列，能与靶基因的GC盒或GACCC盒结合，激活或抑制其靶基因，进而调节VEC功能[11]。

2 KLF2的表观遗传修饰

表观遗传修饰是DNA-组蛋白复合物的可塑动态变化，其通过改变转录因子对染色质的结合能力来快速改变相关基因的转录活性。其机制主要包括DNA甲基化、染色质重塑、组蛋白共价修饰和非编码RNA等[12]。血流动力学、炎症、氧化应激等因素引起KLF2表观遗传修饰，使KLF2表达量发生变化，进而调节VEC各种生理效应。

2.1 血流动力学

血流动力学是引起KLF2表观遗传修饰的因素之一。血管中局部血流动力学改变会影响细胞代谢，并触发VEC的表观遗传改变[13]。层流剪切应力可通过磷脂酰肌醇激酶（Phosphatidylinositol kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）依赖的染色质重建信号通路调节VEC 中KLF2 的表达，这主要通过增加核仁素的表达实现[14]。用PI3K特异性抑制剂LY294002预处理人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）后，核仁素可在层流切应力下与p85（PI3K的修饰亚基）交互，使PI3K参与KLF2启动子的机械活化；核仁素一方面可自身结合于KLF2启动子并激活其表达，另一方面可与不均一核糖核蛋白D（Heterogeneous ribonucleoprotein-D，hnRNP-D）相互作用形成共激活复合物，进而与KLF2启动子结合并促进其表达，hnRNP-D和p300/ CBP相关因子（p300/CBP-associating facto，PCAF）都依赖PI3K/AKT通路与KLF2启动子结合，并可使其组蛋白H3、H4乙酰化，染色质结构变松弛，从而促进KLF2的表达[14]。这些发现表明层流剪切应力作用下的KLF2表观遗传修饰可能与PI3K/AKT通路有密切联系。然而，关于该通路调节KLF2表达量的机制目前尚无定论。Johannes等人报道层流剪切应力使PI3K/AKT快速（15s）瞬时激活，长时间（>24h）的层流剪切应力将降低HUVECs中PI3K/AKT通路磷酸化水平，进而增强KLF2 mRNA的稳定性[15]；Ding等人则认为振荡剪切应力通过激活PI3K/AKT通路，诱导IIa类HDACs与MEF2结合，使后者去乙酰化，下调KLF2表达量[8]。

此外，VEC可在层流剪切应力作用下释放ATP，通过激活后者特异性P2X4受体，诱导钙内流和细胞外信号调节激酶（Extracellular signal regulated protein kinase 5，ERK5）磷酸化，在已建立的ERK5/MEF2通路中调节KLF2表达[16]；而振荡剪切应力可抑制ERK5/MEF2通路，使KLF2的表达下调[17]。层流剪切应力还可通过Ca2+和钙调素依赖激酶依赖性途径刺激VEC中IIa类HDACs的磷酸化和核输出，诱导其和MEF2 的解离，增强MEF2 的转录活性，上调KLF2表达[5]。层流剪切应力还可解除HDAC5与KLF2蛋白的结合，提高KLF2转录活性，促进其靶基因eNOS的表达[8]。这些研究表明，HDAC5可能为VEC功能障碍的预防和动脉粥样硬化、缺血性脑卒中等心血管疾病提供一个新的治疗靶点。

一些研究则表明miR-92a在振荡剪切应力对KLF2负性调节过程中的重要作用。振荡剪切应力通过促进miR-92a的表达，使得更多的miR-92a在AGO蛋白质1（Argonaute-1， AGO1）的介导下，与KLF2 mRNA结合，组装成小RNA诱导的沉默复合体，后者通过募集AGO2，降低KLF2 mRNA转录活性，从而抑制KLF2及其靶基因eNOS和TM的表达；而使用miR-92a抑制剂处理后，KLF2、eNOS和TM的表达量均增加[18]；且KLF2和KLF4的过表达可逆转miR-92a的这种抑制作用[19]。这些结果表明，在引起动脉粥样硬化的湍流作用力下，VEC功能的紊乱主要是由miR-92a上调所引起，但关于血流动力学调节miR-92a表达的机制仍需进一步研究。

2.2 炎症

炎症反应时淋巴细胞和单核-巨噬细胞可被激活并产生白细胞介素1β（Lnterleukin - 1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎症介质，通过调节核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）和PI3K等通路，以及引起VEC内关键基因的表观遗传修饰，从而降低一氧化碳的合成和生理利用率，增加活性氧（Reactive oxygen species，ROS）等产物，造成血管收缩和细胞、组织损伤[20,21]。TNF-α可减弱层流剪切应力对KLF2表达量的增强效应[22]，这一过程需要p65参与，后者通过募集HDAC4和HDAC5并与其相互作用形成复合物，在HDAC4末端18个氨基酸序列的介导下与MEF2结合，抑制KLF2转录[22]。另一炎症介质脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）通过增加甲基转移酶的表达使KLF2下调，进而影响VEC功能[23]。此外，Sirt1的过表达减少了颗粒物（Particulate matter，PM2.5）导致的肺内VEC中KLF2表达量的降低幅度，其中机制可能涉及MEF2；KLF2表达量的上调降低了NF-κB活性，进而抑制了PM2.5引起的肺内炎症和凝血反应[24]。

PI3K/AKT介导的KLF2调控具有减轻炎症反应的作用。肺炎链球菌感染时，跨膜受体Toll样受体2和胞浆核苷酸结合寡聚化结构域可识别病原菌，诱导PI3K的两个亚基p55α和p58α磷酸化，激活PI3K通路，促进肺内VEC中KLF2表达，进而抑制NF-κB和IL-8，控制炎症和防止炎症失控所导致的器官衰竭[25]。此外，血管生成素1与其TEK酪氨酸激酶受体2结合后，通过增强PI3K/AKT通路活性，促进MEF2转录和KLF2表达，进而促进机体血管活动静止，以此对抗血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）诱导的炎症和血管生成反应；这一途径中AKT与MEF2之间分子联系的机制尚未清楚，可能跟转录共激活因子p300和PCAF与MEF2的结合有关[26]。因此，PI3K/AKT通路或许可作为抗炎药开发的一种新方向。

2.3 氧化应激

VEC在受到刺激后会产生过氧化物（Hydrogen peroxide，H2O2），氧化低密度脂蛋白（Oxidation modifies LDL，ox-LDL），高半胱氨酸和高级糖基终产物（High glycemic end product，AGE）等物质，这些物质以较高浓度持续存在于血浆或组织中，并主要通过氧自由基的过氧化反应引起胞膜脂质的过氧化和蛋白质、核酸变性[27]。有研究发现氧化应激可通过表观遗传修饰调节多条信号通路和多个酶的活性，从而促进VEC凋亡[28]。表观遗传修饰还可通过影响氧化应激中ROS的产生与清除，以及氧化还原平衡调控通路中关键分子的表达，从多个方面参与机体氧化平衡系统的调控[29]。在糖尿病中，H2O2和AGE可通过诱导小泛素样修饰物SUMO的E2连接酶和E3连接酶来促进ERK5泛素化，而ERK5的泛素化可降低自身转录活性，通过ERK5/MEF2通路降低KLF2的表达量[30]。同时，高血糖的长期刺激也可降低此通路的磷酸化水平，增加KLF2靶基因内皮素的表达，从而引起糖尿病血管的特征性改变[31]。

p66shc属于SH2包含蛋白线粒体衔接子家族，是一种氧化还原酶，参与线粒体ROS生成和氧化信号翻译。在H2O2或紫外线介导的氧化应激中，p66shc的ser36磷酸化将增加氧化应激敏感性[32]。研究发现血浆S-腺苷同型半胱氨酸浓度升高可降低DNA甲基转移酶1（DNA methyl transferase-1，DNMT1）活性，造成VEC中p66shc启动子低甲基化，引起p66shc介导的VEC氧化应激反应和功能障碍[27]。p66shc主要依赖于MEF2A，通过抑制ERK5/MEF2通路，或者促进核呼吸因子1与MEF2A启动子结合，进而促进p66shc结合于KLF2启动子，下调KLF2表达[33]。进一步研究报道LDL可通过上调p66shc，调控KLF2，但这不是其调控作用的主要途径；LDL主要诱导DNMT1在转录水平修饰KLF2，同时将原先结合于KLF2启动子的MEF2替换成由甲基CGP结合蛋白2和zeste同系物2组成的转录抑制复合物，从而抑制KLF2表达[34]。综上所述，p66shc和KLF2可能有望成为氧化应激相关的心血管疾病治疗靶点。

2.4 其他

WWP1可与KLF2蛋白结合，促进其泛素化和蛋白酶降解途径[10]；肿瘤抑制因子FBW7可靶向促进KLF2蛋白的泛素化降解[35]。以上两个研究提供了KLF2翻译后水平调节的机制。此外，p53可与KLF2结合并募集IIa类HDACs结合于KLF2启动子，使KLF2基因的组蛋白去乙酰化，染色质结构变紧密，降低KLF2的转录活性；敲除p53基因可增加KLF2表达[36]。内皮集落形成细胞中，VEGF可促进HDAC5磷酸化，上调KLF2表达[37]。

3 结论

综上所述，KLF2的表观遗传修饰受多种因素影响，在KLF2的转录调节中发挥重要作用；作为转录因子，KLF2则通过调控靶基因的表达对VEC功能进行调节。作为VEC功能调控位点，KLF2有望成为心血管疾病的药物治疗靶点及药物疗效评估标准，为心血管药物的开发提供新思路。然而，目前对KLF2的研究仍存在不足，以下问题仍需解决：①KLF2对VEC保护机制的研究大多为体外实验，缺乏体内实验，两者最好相互补充和验证，以解释体内外实验结果的差异；②共同刺激因素下，淋巴细胞、巨噬细胞中KLF2表达量的变化情况及调控机制，及其与VEC中KLF2转录活性变化的联系仍需深入探究。